Polarisationsmikroskopie

Mit der Polarisationsmikroskopie können Sie Untersuchungsobjekte im Licht untersuchen, das von zwei Strahlen gebildet wird, die in zueinander senkrechten Ebenen polarisiert sind, d. h. in polarisiertem Licht. Dazu werden Filmpolaroide oder Nicolas-Prismen verwendet, die im Mikroskop zwischen Lichtquelle und Präparat platziert werden. Die Polarisation ändert sich, wenn Lichtstrahlen verschiedene Strukturkomponenten von Zellen und Geweben, deren Eigenschaften inhomogen sind, durchdringen oder von diesen reflektiert werden.

Bei optisch isotropen Strukturen hängt die Ausbreitungsgeschwindigkeit von polarisiertem Licht nicht von der Polarisationsebene ab, bei anisotropen Strukturen ändert sie sich abhängig von der Lichtrichtung entlang der Längs- oder Querachse des Objekts. Wenn der Brechungsindex des Lichts entlang der Struktur größer ist als in Querrichtung, tritt eine positive Doppelbrechung auf, mit dem umgekehrten Verhältnis - negative Doppelbrechung. Viele biologische Objekte haben eine strikte molekulare Orientierung, sind anisotrop und verursachen eine positive Doppelbrechung des Lichts.

Dunkelfeldmikroskopie

Bei der Dunkelfeldmikroskopie wird die Probe von der Seite mit schrägen Strahlenbündeln beleuchtet, die nicht in die Linse einfallen. In die Linse treten nur Strahlen ein, die durch Reflexion, Brechung oder Beugung von Partikeln des Arzneimittels abgelenkt werden. Aus diesem Grund scheinen Mikrobenzellen und andere Partikel vor einem schwarzen Hintergrund hell zu leuchten (das Bild ähnelt einem funkelnden Sternenhimmel).

Für die Mikroskopie im Dunkelfeld werden ein spezieller Kondensor (Paraboloidkondensor oder Nierenkondensator) und konventionelle Objektive verwendet. Da die Apertur des Immersionsobjektivs größer ist als die des Dunkelfeldkondensors, wird eine spezielle Tubusblende im Inneren des Immersionsobjektivs eingesetzt, um die Apertur zu verkleinern.

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Einführung

Lichtmikroskop

Elektronenmikroskopie

Polarisationsmikroskopie

Anhang 1

Lichtmikroskop

Die Lichtmikroskopie ist die älteste und zugleich eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Erforschung und Untersuchung von Pflanzen- und Tierzellen. Es wird angenommen, dass die Erforschung der Zellen gerade mit der Erfindung des Lichtmikroskops begann. Hauptmerkmal Lichtmikroskop ist die Auflösung des Lichtmikroskops, bestimmt durch die Wellenlänge des Lichts. Die Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskops wird durch die Wellenlänge des Lichts bestimmt, ein optisches Mikroskop wird verwendet, um Strukturen zu untersuchen, die eine minimale Größe haben, die der Wellenlänge der Lichtstrahlung entspricht. Viele Zellbestandteile haben eine ähnliche optische Dichte und erfordern eine Vorbearbeitung vor dem Mikroskopieren, ansonsten sind sie in einem herkömmlichen Lichtmikroskop praktisch unsichtbar. Um sie sichtbar zu machen, werden verschiedene Farbstoffe mit einer gewissen Selektivität verwendet. Mit selektiven Farbstoffen wird es möglich, die innere Struktur der Zelle genauer zu untersuchen.

Zum Beispiel:

der Farbstoff Hämatoxylin färbt einige Kernkomponenten blau oder violett;

nach sukzessiver Behandlung mit Phloroglucinol und dann mit Salzsäure werden die verholzten Zellmembranen kirschrot;

Sudan III Farbstoff färbt verkorkte Zellmembranen rosa;

eine schwache Lösung von Jod in Kaliumjodid färbt Stärkekörner blau.

Bei mikroskopischen Untersuchungen werden die meisten Gewebe vor Beginn der Färbung fixiert.

Nach der Fixierung werden die Zellen durchlässig für Farbstoffe und die Zellstruktur wird stabilisiert. Eines der gebräuchlichsten Fixiermittel in der Botanik ist Ethylalkohol.

Bei der Vorbereitung der Präparation für die Mikroskopie werden Dünnschliffe auf einem Mikrotom angefertigt (Anlage 1, Abb. 1). Dieses Gerät arbeitet nach dem Prinzip des Brotschneidens. Für Pflanzengewebe werden etwas dickere Schnitte angefertigt als für Tiere, da Pflanzenzellen relativ groß sind. Die Dicke von Pflanzengewebeschnitten für - 10 Mikrometer - 20 Mikrometer. Manche Tücher sind zu weich, um sofort geschnitten zu werden. Daher werden sie nach dem Fixieren in geschmolzenes Paraffin oder ein spezielles Harz gegossen, das das gesamte Gewebe imprägniert. Nach dem Abkühlen entsteht ein fester Block, der dann auf einem Mikrotom geschnitten wird. Dies liegt daran, dass Pflanzenzellen starke Zellwände haben, die das Gewebegerüst bilden. Verholzte Därme sind besonders stark.

Bei der Füllung während der Zubereitung des Schnitts besteht die Gefahr, die Struktur der Zelle zu zerstören; um dies zu verhindern, verwenden sie die Methode des Schnellgefrierens. Bei dieser Methode entfällt das Fixieren und Füllen. Das gefrorene Gewebe wird auf einem speziellen Mikrotom - Kryotom (Anhang 1, Abb. 2) geschnitten.

Gefrorene Abschnitte behalten ihre natürliche Textur besser. Sie sind jedoch schwieriger zuzubereiten und das Vorhandensein von Eiskristallen stört einige Details.

Phasenkontrast- (Anhang 1, Abb. 3) und Interferenz-Mikroskope (Anhang 1, Abb. 4) ermöglichen die Untersuchung lebender Zellen unter dem Mikroskop mit deutlicher Darstellung ihrer Strukturdetails. Diese Mikroskope verwenden 2 Lichtwellenstrahlen, die sich gegenseitig beeinflussen (überlagern), wodurch die Amplitude der Wellen, die von verschiedenen Komponenten der Zelle in das Auge eintreten, erhöht oder verringert wird.

Die Lichtmikroskopie hat mehrere Varianten.

Hellfeldmethode und ihre Varianten

Hellfeld im Durchlicht verwendet bei der Untersuchung transparenter Präparate mit lichtabsorbierenden Partikeln und darin enthaltenen Details (dünne farbige Schnitte von tierischen und pflanzlichen Geweben, dünne Schnitte von Mineralien). Ohne Präparation erzeugt ein Lichtstrahl vom Kondensor, der durch das Objektiv geht, ein gleichmäßig beleuchtetes Feld in der Nähe der Brennebene des Okulars. Bei Vorhandensein eines absorbierenden Elements in der Zubereitung wird das darauf einfallende Licht teilweise absorbiert und teilweise gestreut, was das Erscheinungsbild des Bildes verursacht. Das Verfahren kann auch bei der Beobachtung von nicht absorbierenden Objekten angewendet werden, jedoch nur, wenn diese den Beleuchtungsstrahl so stark streuen, dass ein wesentlicher Teil davon nicht in die Linse fällt.

Schräge Beleuchtungsmethode- eine Variation der vorherigen Methode. Der Unterschied besteht darin, dass das Licht in einem großen Winkel zur Beobachtungsrichtung auf das Objekt gerichtet wird. Manchmal hilft es, das "Relief" des Objekts durch die Bildung von Schatten sichtbar zu machen.

Auflicht-Hellfeld-Methode Es wird bei der Untersuchung von undurchsichtigen Objekten verwendet, die Licht reflektieren, wie z. B. dünne Abschnitte von Metallen oder Erzen. Die Beleuchtung des Präparats (von einem Illuminator und einem halbdurchlässigen Spiegel) erfolgt von oben durch das Objektiv, das gleichzeitig die Rolle eines Kondensors spielt. In der Abbildung, die das Objektiv zusammen mit der Tubuslinse in der Ebene erzeugt, ist die Struktur des Präparats aufgrund des unterschiedlichen Reflexionsvermögens seiner Elemente sichtbar; im Hellfeld werden auch Inhomogenitäten unterschieden, die das einfallende Licht streuen.

Dunkelfeldmethode und ihre Varianten

Dunkelfeldmethode im Durchlicht wird verwendet, um Bilder von transparenten, nicht absorbierenden Objekten zu erzeugen, die mit der Hellfeldmethode nicht gesehen werden können. Dies sind oft biologische Objekte. Das Licht des Illuminators und des Spiegels wird durch einen speziellen Kondensor - den sogenannten Kondensor - auf das Präparat gelenkt. Dunkelfeld-Kondensator. Beim Verlassen des Kondensors bildet der Hauptteil der Lichtstrahlen, die beim Durchgang durch das transparente Präparat ihre Richtung nicht geändert haben, einen Strahl in Form eines Hohlkegels und fällt nicht in die Linse (die sich innerhalb dieses Kegels befindet) ). Das Bild im Mikroskop entsteht mit Hilfe nur eines kleinen Teils der von Mikropartikeln des Präparats auf dem Objektträger im Inneren des Konus gestreuten und durch das Objektiv geleiteten Strahlen. Im Sichtfeld vor dunklem Hintergrund helle Bilder der Strukturelemente des Präparats abweichend von Umfeld Brechungsindex. Bei großen Partikeln sind nur helle Kanten sichtbar, die Lichtstrahlen streuen. Bei dieser Methode lässt sich anhand der Bildart nicht feststellen, ob Partikel transparent oder opak sind, sie haben im Vergleich zur Umgebung einen höheren oder niedrigeren Brechungsindex.

Elektronenmikroskopie

Das erste Elektronenmikroskop wurde 1931 von Knoll und Ruska in Deutschland konstruiert. Erst in den 50er Jahren wurden die Methoden zur Herstellung von Scheiben mit den notwendigen Qualitäten entwickelt.

Die Schwierigkeiten der Elektronenmikroskopie liegen darin, dass zur Untersuchung biologischer Proben eine spezielle Aufbereitung der Präparate erforderlich ist.

Die erste Schwierigkeit besteht darin, dass Elektronen eine sehr begrenzte Durchschlagskraft haben, daher sollten ultradünne Schnitte mit einer Dicke von 50 - 100 nm hergestellt werden. Um so dünne Schnitte zu erhalten, werden die Gewebe zunächst mit Harz imprägniert: Das Harz polymerisiert und bildet einen harten Kunststoffblock. Anschließend werden die Schnitte mit einem scharfen Glas- oder Diamantmesser auf einem speziellen Mikrotom geschnitten.

Es gibt noch eine weitere Schwierigkeit: Wenn Elektronen biologisches Gewebe durchdringen, ist dies nicht möglich Kontrastbild... Um einen Kontrast zu erhalten, werden Dünnschnitte biologischer Proben mit Schwermetallsalzen imprägniert.

Es gibt zwei Haupttypen von Elektronenmikroskopen. In einem Transmissions-(Transmissions-)Mikroskop hinterlässt ein Elektronenstrahl, der durch eine speziell präparierte Probe geht, sein Bild auf dem Bildschirm. Die Auflösung eines modernen Tist fast 400-mal höher als die eines leichten. Diese Mikroskope haben eine Auflösung von etwa 0,5 nm.

Trotz einer so hohen Auflösung haben Tgroße Nachteile:

Sie müssen mit festen Materialien arbeiten;

das Bild auf dem Bildschirm ist zweidimensional (flach);

Bei der Verarbeitung mit Schwermetallen werden einige Zellstrukturen zerstört und verändert.

Ein dreidimensionales (volumetrisches) Bild wird unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (EM) erhalten. Dabei durchdringt der Strahl die Probe nicht, sondern wird von deren Oberfläche reflektiert.

Das Prüfmuster wird fixiert und getrocknet, wonach es mit einer dünnen Metallschicht bedeckt wird, ein Vorgang, der als Schattierung bezeichnet wird (die Probe wird schattiert).

Bei der Scanning-EM wird ein fokussierter Elektronenstrahl auf die Probe gerichtet (die Probe wird gescannt). Als Ergebnis emittiert die Metalloberfläche der Probe Sekundärelektronen niedriger Energie. Sie werden registriert und auf einem Fernsehbildschirm in ein Bild umgewandelt. Die maximale Auflösung eines Rastermikroskops ist klein, etwa 10 nm, aber das Bild ist dreidimensional.

Arten der Elektronenmikroskopie:

Amplituden-Elektronenmikroskopie- Methoden der Amplitudenelektronenmikroskopie können verwendet werden, um Bilder von amorphen und anderen Körpern (deren Partikelgröße kleiner ist als die in einem Elektronenmikroskop aufgelöste Entfernung) zu verarbeiten, die Elektronen diffus streuen. In einem Transmissionselektronenmikroskop beispielsweise ist der Kontrast des Bildes, d. h. der Unterschied in der Helligkeit des Bildes benachbarter Bereiche des Objekts, in erster Näherung proportional zum Unterschied der Dicken dieser Bereiche.

Phasenelektronenmikroskopie- Um den Kontrast von Bildern zu berechnen kristalline Körper mit regelmäßigen Strukturen, sowie zur Lösung des inversen Problems - Berechnung der Struktur eines Objekts aus dem beobachteten Bild - werden Methoden der Phasenelektronenmikroskopie eingesetzt. Das Beugungsproblem wird betrachtet Elektronenwelle auf einem Kristallgitter, bei dessen Lösung zusätzlich inelastische Wechselwirkungen von Elektronen mit einem Objekt berücksichtigt werden: Streuung an Plasmen, Phononen etc. In Trund Rastertrhoher Auflösung Aufnahmen einzelner Moleküle oder Atome von schweren Elementen erhalten. Mit den Methoden der Phasenelektronenmikroskopie ist es möglich, die dreidimensionale Struktur von Kristallen und biologischen Makromolekülen aus Bildern zu rekonstruieren.

Quantitative Elektronenmikroskopie- Methoden der quantitativen Elektronenmikroskopie sind genaue Messungen verschiedener Parameter einer Probe oder eines zu untersuchenden Prozesses, zum Beispiel die Messung lokaler elektrischer Potentiale, magnetischer Felder, Mikrogeometrie des Oberflächenreliefs usw.

Lorentz-Elektronenmikroskopie- Das Studiengebiet der Lorentz-Elektronenmikroskopie, in dem die durch die Lorentz-Kraft verursachten Phänomene untersucht werden, sind interne magnetische und elektrische Felder oder externe Streufelder, zum Beispiel Felder magnetischer Domänen in dünnen Filmen, ferroelektrische Domänen, Felder von Köpfen zur magnetischen Datenaufzeichnung usw.

Polarisationsmikroskopie

Polarisationsmikroskopie ist eine Beobachtungsmethode in polarisiertem Licht zur mikroskopischen Untersuchung von Präparaten, die optisch anisotrope Elemente enthalten (oder vollständig aus solchen Elementen bestehen). Dies sind viele Mineralien, Körner in dünnen Schichten von Legierungen, einige tierische und pflanzliche Gewebe usw. Die Beobachtung kann sowohl im Durchlicht als auch im Auflicht erfolgen. Das von der Beleuchtungseinrichtung emittierte Licht wird durch einen Polarisator geleitet. Die ihm in diesem Fall gemeldete Polarisation ändert sich mit dem anschließenden Durchgang von Licht durch das Medikament (oder dessen Reflexion). Diese Veränderungen werden unter Verwendung eines Analysators und verschiedener optischer Kompensatoren untersucht. Analysiert man solche Veränderungen, kann man die wichtigsten optischen Eigenschaften anisotroper Mikroobjekte beurteilen: die Stärke der Doppelbrechung, die Anzahl der optischen Achsen und deren Orientierung, Drehung der Polarisationsebene und Dichroismus.

Phasenkontrastverfahren

Methode Phasenkontrast und seine Vielfalt - die sogenannte. Methode "Anoptraler" Kontrast sind dazu bestimmt, Bilder von transparenten und farblosen Objekten zu erhalten, die bei Betrachtung mit der Hellfeldmethode unsichtbar sind. Dazu gehören zum Beispiel lebende, unbemalte Tiergewebe. Das Wesen des Verfahrens besteht darin, dass selbst bei sehr kleinen Unterschieden in den Brechungsindizes verschiedener Elemente des Präparats die durch sie hindurchtretende Lichtwelle unterschiedliche Phasenänderungen erfährt (erhält das sogenannte Phasenrelief). Diese Phasenänderungen, die weder vom Auge noch von der fotografischen Platte direkt wahrgenommen werden, werden mit Hilfe einer speziellen optischen Vorrichtung in Amplitudenänderungen der Lichtwelle, also Helligkeitsänderungen ("Amplitudenrelief") umgewandelt, die bereits mit dem Auge unterscheidbar oder auf der lichtempfindlichen Schicht fixiert sind. Mit anderen Worten, im resultierenden sichtbaren Bild gibt die Helligkeitsverteilung (Amplituden) das Phasenrelief wieder. Das resultierende Bild wird Phasenkontrast genannt.

Typisches Schema des Verfahrens: Im vorderen Fokus des Kondensors ist eine Aperturblende installiert, deren Öffnung ringförmig ist. Sein Bild erscheint in der Nähe des Backfokus des Objektivs und der sogenannten. eine Phasenplatte, auf deren Oberfläche sich ein ringförmiger Vorsprung oder eine ringförmige Nut befindet, die als Phasenring bezeichnet wird. Die Phasenplatte befindet sich nicht immer im Fokus des Objektivs - oft wird der Phasenring direkt auf die Oberfläche einer der Objektivlinsen aufgebracht.

In jedem Fall müssen die Strahlen des Illuminators, die im Präparat nicht abgelenkt werden, die das Bild der Blende ergeben, den Phasenring vollständig durchlaufen, was sie erheblich schwächt (er wird absorbierend gemacht) und ihre Phase um l / ändert 4 (l ist die Wellenlänge des Lichts). Und die im Präparat leicht abgelenkten (gestreuten) Strahlen passieren die Phasenplatte unter Umgehung des Phasenrings und erfahren keine zusätzliche Phasenverschiebung.

Unter Berücksichtigung der Phasenverschiebung im Material des Präparats liegt die Gesamtphasendifferenz zwischen den abgelenkten und nicht abgelenkten Strahlen nahe 0 oder l / 2 und als Ergebnis der Lichtinterferenz in der Bildebene des Präparats , sie verstärken oder schwächen sich gegenseitig merklich und geben ein kontrastreiches Bild der Struktur des Präparats. Die abgelenkten Strahlen haben eine deutlich geringere Amplitude als die nicht abgelenkten, daher führt auch die Abschwächung des Hauptstrahls im Phasenring, die die Amplituden näher zusammenbringt, zu einem höheren Bildkontrast.

Das Verfahren ermöglicht die Unterscheidung zwischen kleinen Strukturelementen, die im Hellfeldverfahren extrem kontrastarm sind. Transparente Partikel, vergleichsweise nicht klein, streuen Lichtstrahlen unter so kleinen Winkeln, dass diese Strahlen zusammen mit den nicht abgelenkten durch den Phasenring gehen. Bei solchen Partikeln tritt der Phasenkontrasteffekt nur in der Nähe ihrer Konturen auf, wo eine starke Streuung auftritt.

Infrarot-Beobachtungsmethode

Methode Infrarotbeobachtung(IR)-Strahlen erfordern auch die Umwandlung eines für das Auge unsichtbaren Bildes in ein sichtbares unter Verwendung von Fotografie oder unter Verwendung eines elektrooptischen Wandlers. Die IR-Mikroskopie ermöglicht es, die innere Struktur von Objekten zu untersuchen, die im sichtbaren Licht undurchsichtig sind, wie dunkle Gläser, einige Kristalle und Mineralien usw.

UV-Beobachtungsmethode

Methode Beobachtungen in ultravioletten (UV) Strahlen ermöglicht es, die Grenzauflösung des Mikroskops zu erhöhen. Der Hauptvorteil des Verfahrens besteht darin, dass Partikel vieler Substanzen, die im sichtbaren Licht transparent sind, UV-Strahlung bestimmter Wellenlängen stark absorbieren und daher in UV-Bildern gut unterscheidbar sind. Viele in pflanzlichen und tierischen Zellen enthaltene Stoffe (Purinbasen, Pyrimidinbasen, die meisten Vitamine, aromatische Aminosäuren, einige Lipide, Thyroxin etc.) weisen charakteristische Absorptionsspektren im UV-Bereich auf.

Da ultraviolette Strahlen für das menschliche Auge unsichtbar sind, werden Bilder in der UV-Mikroskopie entweder fotografisch oder unter Verwendung eines Bildwandlers oder eines Fluoreszenzschirms aufgezeichnet. Das Medikament wird in drei UV-Wellenlängen fotografiert. Jedes der resultierenden Negative wird mit sichtbarem Licht einer bestimmten Farbe (zB Blau, Grün und Rot) beleuchtet und alle werden gleichzeitig auf einen einzigen Bildschirm projiziert. Das Ergebnis ist ein Farbbild eines Objekts in herkömmlichen Farben, abhängig von der Absorptionskapazität des Arzneimittels im ultravioletten Licht.

Mikrofotografie und Mikrokino- Dies ist die Aufnahme mit einem Mikroskop von Bildern auf lichtempfindlichen Schichten. Diese Methode wird häufig in Verbindung mit allen anderen Methoden der mikroskopischen Untersuchung verwendet. Für die Mikrofoto- und Mikrofilmfotografie ist eine gewisse Umstrukturierung des optischen Systems des Mikroskops erforderlich - anders als die visuelle Beobachtung der Fokussierung des Okulars relativ zum vom Objektiv gelieferten Bild. Die Mikrofotografie ist bei der Dokumentation von Forschungen, bei der Untersuchung von Objekten in für das Auge unsichtbaren UV- und IR-Strahlen (siehe oben) sowie von Objekten mit schwacher Leuchtintensität erforderlich. Die Mikrocine-Fotografie ist unverzichtbar bei der Untersuchung von Vorgängen, die sich mit der Zeit abspielen (Lebensaktivität von Gewebezellen und Mikroorganismen, Kristallwachstum, Ablauf einfachster chemischer Reaktionen etc.).

Interferenzkontrastverfahren

Das Interferenzkontrastverfahren (Interferenzmikroskopie) besteht darin, dass jeder Strahl gegabelt wird und in das Mikroskop eintritt. Einer der empfangenen Strahlen wird durch das beobachtete Teilchen geleitet, der andere - vorbei an demselben oder einem zusätzlichen optischen Zweig des Mikroskops. Im Okular des Mikroskops verbinden sich beide Strahlen wieder und überlagern sich. Kondensor und Linse sind mit doppelbrechenden Platten ausgestattet, von denen die erste den ursprünglichen Lichtstrahl in zwei Strahlen aufspaltet und die zweite diese wieder vereint. Einer der das Objekt durchdringenden Strahlen ist phasenverzögert (erhält einen Gangunterschied im Vergleich zum zweiten Strahl). Die Größe dieser Verzögerung wird durch den Kompensator gemessen. Dieses Verfahren ermöglicht die Betrachtung transparenter und farbloser Objekte, ihre Bilder können aber auch mehrfarbig sein (Störfarben). Diese Methode eignet sich zur Untersuchung lebender Gewebe und Zellen und wird in vielen Fällen genau zu diesem Zweck eingesetzt. Das Interferenzkontrastverfahren wird häufig in Verbindung mit anderen Mikroskopieverfahren verwendet, insbesondere bei der Beobachtung in polarisiertem Licht. Durch den Einsatz in Kombination mit der Ultraviolett-Mikroskopie ist es beispielsweise möglich, den Gehalt an Nukleinsäuren in der Gesamttrockenmasse eines Objekts zu bestimmen.

Forschungsmethode im Licht der Lumineszenz

Methode Forschung im Licht der Lumineszenz besteht darin, das grün-orange Leuchten von Mikroobjekten unter einem Mikroskop zu beobachten, das auftritt, wenn sie mit blau-violettem Licht oder für das Auge unsichtbaren ultravioletten Strahlen beleuchtet werden. Zwei Lichtfilter werden in das optische Schema des Mikroskops eingeführt. Einer von ihnen wird vor dem Kondensator platziert. Es lässt von der Lichtquelle nur Strahlung derjenigen Wellenlängen durch, die entweder die Lumineszenz des Objekts selbst (intrinsische Lumineszenz) oder spezielle Farbstoffe anregen, die in das Präparat eingebracht und von seinen Partikeln absorbiert werden (Sekundärlumineszenz). Der zweite Lichtfilter, der nach dem Objektiv eingebaut ist, lässt nur Lumineszenzlicht zum Auge des Betrachters (oder auf die lichtempfindliche Schicht) gelangen. Bei der Lumineszenzmikroskopie werden Präparate sowohl von oben (durch das Objektiv, das in diesem Fall auch als Kondensor dient) als auch von unten durch einen herkömmlichen Kondensor beleuchtet. Das Verfahren hat breite Anwendung in der Mikrobiologie, Virologie, Histologie, Zytologie, in der Lebensmittelindustrie, in der Bodenforschung, in der mikrochemischen Analyse und in der Defektoskopie gefunden. Diese Anwendungsvielfalt erklärt sich aus der sehr hohen Farbempfindlichkeit des Auges und dem hohen Kontrast des Bildes eines selbstleuchtenden Objekts vor einem dunklen, nicht leuchtenden Hintergrund.

Replikatmethode

Die Replika-Methode wird verwendet, um die geometrische Oberflächenstruktur von massiven Körpern zu untersuchen. Von der Oberfläche eines solchen Körpers wird ein Abdruck in Form eines dünnen Films aus Kohlenstoff, Kollodium, Formvar usw. genommen, das Oberflächenrelief wiederholt und in einem Transmissionselektronenmikroskop betrachtet. Normalerweise wird in einem Gleitwinkel (klein zur Oberfläche) eine Schicht aus Schwermetall, die Elektronen streut, im Vakuum unter einem Gleitwinkel (klein zur Oberfläche) auf der Replik abgeschieden, wodurch die Kämme und Täler des geometrischen Reliefs abgeschattet werden.

Dekorationsmethode

Die Dekorationsmethode untersucht nicht nur die geometrische Struktur von Oberflächen, sondern auch Mikrofelder, die durch das Vorhandensein von Versetzungen, Ansammlung von Punktdefekten, Wachstumsschritte von Kristallflächen, Domänenstruktur usw. verursacht werden. Bei dieser Methode wird eine sehr dünne Schicht von Dekorationspartikeln (Au-Atome, Pt usw., Moleküle von Halbleitern oder Dielektrika), die hauptsächlich in den Konzentrationsbereichen von Mikrofeldern abgeschieden werden, und dann wird eine Replik mit Einschlüssen von Dekorationspartikeln entfernt.

Zur Gewinnung von Zellfraktionen sind verschiedene Zentrifugationsarten weit verbreitet: Differentialzentrifugation, Zonenzentrifugation und Gleichgewichtszentrifugation in einem Dichtegradienten. Theoretische und praktische Fragen im Zusammenhang mit der Zentrifugation werden in der Übersicht von Sykes umfassend diskutiert.

Differenzzentrifugation

Bei der Differenzzentrifugation werden die Proben eine gewisse Zeit bei einer bestimmten Geschwindigkeit zentrifugiert, wonach der Überstand entfernt wird. Dieses Verfahren ist nützlich, um Partikel zu trennen, die sich in der Sedimentationsgeschwindigkeit stark unterscheiden. Beispielsweise führt eine Zentrifugation für 5-10 min bei 3000-5000 d zur Präzipitation intakter Bakterienzellen, während die meisten Zellfragmente im Überstand verbleiben. Zellwandfragmente und große Membranstrukturen können durch Zentrifugation bei 20.000 bis 50.000 G für 20 Minuten präzipitiert werden, während kleine Membranvesikel und Ribosomen eine Zentrifugation bei 200.000 G für 1 Stunde zum Pelletieren erfordern.

Zonenzentrifugation

Zonenzentrifugation ist effektive Methode Trennung von Strukturen, die eine ähnliche Auftriebsdichte haben, sich jedoch in Form und Masse der Partikel unterscheiden. Beispiele sind die Trennung von Ribosomen-Untereinheiten, verschiedene Klassen von Polysomen und DNA-Moleküle mit unterschiedlichen Formen. Die Zentrifugation erfolgt entweder in Becherrotoren oder in speziell angeordneten Zonenrotoren; Um Konvektion während der Zentrifugation zu verhindern, wird in den Bechern des Becherrotors oder in der zonalen Rotorkammer ein schwacher Gradient (meist Saccharose) erzeugt. Die Probe wird in Form einer Zone oder eines schmalen Streifens ganz oben auf die Gradientensäule aufgetragen. Für subzelluläre Partikel wird typischerweise ein Saccharosegradient von 15 bis 40% (w/v) verwendet.

Laue-Methode

für Einkristalle verwendet. Die Probe wird mit einem kontinuierlichen Spektrum bestrahlt, die gegenseitige Orientierung von Strahl und Kristall ändert sich nicht. Die Winkelverteilung der gebeugten Strahlung hat die Form einzelner Beugungsflecken (laue-Muster).

Debye-Scherrer-Methode

Es wird verwendet, um Polykristalle und deren Mischungen zu untersuchen. Die chaotische Orientierung der Kristalle in der Probe relativ zum einfallenden monochromatischen Strahl wandelt die gebeugten Strahlen in eine Familie von koaxialen Kegeln mit dem einfallenden Strahl auf der Achse um. Ihr Bild auf fotografischem Film (Debyegram) hat die Form konzentrischer Ringe, deren Lage und Intensität eine Beurteilung der Zusammensetzung der untersuchten Substanz ermöglicht.

Zellkulturmethode

Manche Gewebe können in einzelne Zellen unterteilt werden, damit die Zellen am Leben bleiben und sich oft vermehren können. Diese Tatsache bestätigt schließlich das Konzept einer Zelle als lebende Einheit. Ein Schwamm, ein primitiver vielzelliger Organismus, kann durch Reiben durch ein Sieb in Zellen unterteilt werden. Nach einer Weile verbinden sich diese Zellen wieder und bilden einen Schwamm. Tierische embryonale Gewebe können durch Enzyme oder andere Mittel, die die Bindungen zwischen Zellen schwächen, zur Dissoziation gebracht werden.

Der amerikanische Embryologe R. Garrison (1879-1959) zeigte als erster, dass embryonale und sogar einige reife Zellen in einer geeigneten Umgebung außerhalb des Körpers wachsen und sich vermehren können. Diese als Zellkultur bezeichnete Technik wurde von dem französischen Biologen A. Carrel (1873-1959) perfektioniert. Pflanzenzellen können auch in Kultur gezüchtet werden, bilden jedoch im Vergleich zu tierischen Zellen große Cluster und sind fester miteinander verbunden, daher werden während des Kulturwachstums Gewebe und keine einzelnen Zellen gebildet. In der Zellkultur kann aus einer einzelnen Zelle eine ganze erwachsene Pflanze, wie beispielsweise eine Karotte, gezüchtet werden.

Mikrofiguria-Methode

Mit Hilfe eines Mikromanipulators können einzelne Teile der Zelle entfernt, hinzugefügt oder in irgendeiner Weise verändert werden. Eine große Amöbenzelle kann in drei Hauptkomponenten unterteilt werden - die Zellmembran, das Zytoplasma und den Zellkern, und dann können diese Komponenten wieder zusammengesetzt und eine lebende Zelle erhalten werden. Auf diese Weise können künstliche Zellen gewonnen werden, die aus Komponenten bestehen verschiedene Typen Amöben.

Berücksichtigt man, dass einige zelluläre Bestandteile künstlich synthetisiert werden können, dann können Experimente zum Zusammenbau künstlicher Zellen der erste Schritt zur Schaffung neuer Lebensformen im Labor sein. Da sich jeder Organismus aus einer einzigen Zelle entwickelt, ermöglicht die Methode zur Herstellung künstlicher Zellen im Prinzip die Konstruktion von Organismen eines bestimmten Typs, wenn gleichzeitig Komponenten verwendet werden, die sich geringfügig von denen in bestehenden Zellen unterscheiden. In Wirklichkeit ist jedoch keine vollständige Synthese aller zellulären Komponenten erforderlich. Die Struktur der meisten, wenn nicht aller Zellbestandteile wird durch Nukleinsäuren bestimmt. Somit wird das Problem der Schaffung neuer Organismen auf die Synthese neuer Arten von Nukleinsäuren und deren Ersatz für natürliche Nukleinsäuren in bestimmten Zellen reduziert.

Zellfusionsmethode

Ein anderer Typ von künstlichen Zellen kann durch Fusion von Zellen des gleichen oder verschiedener Typen erhalten werden. Um eine Fusion zu erreichen, werden Zellen viralen Enzymen ausgesetzt; In diesem Fall kleben die äußeren Oberflächen zweier Zellen zusammen und die Membran zwischen ihnen wird zerstört, und es entsteht eine Zelle, in der zwei Chromosomensätze in einem Kern eingeschlossen sind. Zellen unterschiedlichen Typs oder in unterschiedlichen Teilungsstadien können fusioniert werden. Unter Verwendung dieses Verfahrens war es möglich, Hybridzellen einer Maus und eines Huhns, eines Menschen und einer Maus, eines Menschen und einer Kröte zu erhalten. Solche Zellen sind nur anfangs hybrid und verlieren nach zahlreichen Zellteilungen die meisten Chromosomen der einen oder anderen Spezies. Das Endprodukt wird beispielsweise im Wesentlichen zu einer Mauszelle, in der menschliche Gene fehlen oder nur in geringen Mengen vorhanden sind. Von besonderem Interesse ist die Verschmelzung von normalen und malignen Zellen. In einigen Fällen werden Hybriden bösartig, in anderen nicht, d.h. beide Eigenschaften können sich sowohl dominant als auch rezessiv manifestieren. Dieses Ergebnis ist nicht unerwartet, da Malignität durch verschiedene Faktoren verursacht werden kann und einen komplexen Mechanismus hat.

Licht für die Zellmikroskopie

Anhang 1

Abbildung 2. Kryotom Abbildung 3. Phasenkontrastmikroskop

Abbildung 4. Interferenzmikroskop

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Die histologische Untersuchung ist die Untersuchung von Geweben unter einem Mikroskop. Und eine zytologische Studie unterscheidet sich von einer histologischen dadurch, dass sie kein Gewebe, sondern eine Studie von Zellen untersucht.

Arten der Mikroskopie

Lichtmikroskopische Methoden
Lichtmikroskopische Methoden (Beleuchtung und Beobachtung). Mikroskopieverfahren werden in Abhängigkeit von der Art und den Eigenschaften der untersuchten Objekte ausgewählt (und konstruktiv bereitgestellt), da letztere, wie oben erwähnt, den Bildkontrast beeinflussen.

Hellfeldmethode und ihre Varianten
Die Hellfeldmethode im Durchlicht wird verwendet, um transparente Präparate mit absorbierenden (lichtabsorbierenden) Partikeln und darin enthaltenen Details zu untersuchen. Dies können zum Beispiel dünne farbige Schnitte von tierischen und pflanzlichen Geweben, dünne Schnitte von Mineralien usw. sein.

Dunkelfeldmethode und ihre Varianten
Ein spezieller Kondensor wird verwendet, um die kontrastierenden Strukturen des unlackierten Materials hervorzuheben. In diesem Fall fallen die Strahlen der Beleuchtung schräg auf die Probe und das Untersuchungsobjekt erscheint im Dunkelfeld beleuchtet.

Phasenkontrastverfahren
Wenn Licht farbige Objekte durchdringt, ändert sich die Amplitude der Lichtwelle, und wenn Licht ungefärbte Objekte durchdringt, ändert sich die Phase der Lichtwelle, was verwendet wird, um ein kontrastreiches Bild zu erhalten.

Polarisationsmikroskopie
Mit der Polarisationsmikroskopie können Sie die ultrastrukturelle Organisation von Gewebekomponenten basierend auf der Analyse von Anisotropie und / oder Doppelbrechung untersuchen

Interferenzkontrastverfahren
Das Interferenzkontrastverfahren (Interferenzmikroskopie) besteht darin, dass jeder Strahl gegabelt wird und in das Mikroskop eintritt. Einer der empfangenen Strahlen wird durch das beobachtete Teilchen geleitet, der andere - vorbei an demselben oder einem zusätzlichen optischen Zweig des Mikroskops. Im Okular des Mikroskops verbinden sich beide Strahlen wieder und überlagern sich. Einer der das Objekt durchdringenden Strahlen ist phasenverzögert (erhält einen Gangunterschied im Vergleich zum zweiten Strahl). Die Größe dieser Verzögerung wird durch den Kompensator gemessen

Forschungsmethode im Licht der Lumineszenz
Die Untersuchungsmethode im Licht der Lumineszenz (Fluoreszenzmikroskopie oder Fluoreszenzmikroskopie) besteht darin, das grün-orange Leuchten von Mikroobjekten unter einem Mikroskop zu beobachten, das auftritt, wenn sie mit blau-violettem Licht oder ultravioletten Strahlen beleuchtet werden, die für das Auge unsichtbar sind Auge.

UV-Mikroskopie... Es basiert auf der Verwendung von ultravioletten Strahlen mit einer Wellenlänge von weniger als 380 nm, wodurch es möglich ist, die Auflösung von Linsen von 0,2 ... 0,3 µm auf 0,11 µm zu erhöhen. Erfordert die Verwendung spezieller ultravioletter Mikroskope, die ultraviolette Illuminatoren, Quarzoptiken und Konverter von ultravioletten Strahlen in den sichtbaren Teil des Spektrums verwenden. Viele Substanzen, aus denen Zellen bestehen (z. B. Nukleinsäuren), absorbieren selektiv ultraviolette Strahlen, die verwendet werden, um die Menge dieser Substanzen in der Zelle zu bestimmen.

Transmissionsmikroskopie... In Transmissionsmikroskopen passieren Elektronen die Probe. Die Elektronenenergie ist relativ gering (bis 50 kV); in diesem Fall werden sie gestreut und absorbiert. Um ein kontrastreiches Bild zu erzeugen, werden spezielle Methoden der Materialvorbereitung verwendet.

Rasterelektronenmikroskope basierend auf einem Scan der Probe. Dabei läuft ein präzise fokussierter Elektronenstrahl über die Oberfläche der Probe und die reflektierten Elektronen bilden ein dreidimensionales Bild. Die Auflösung eines Rastermikroskops ist geringer als die eines Transmissionsmikroskops (5 ... 20 nm).

Hochspannungs-Elektronenmikroskope basieren auf der Verwendung von ultrahochenergetischen Elektronen (bis zu 1 MV - eine Million Volt). Solche starken Strahlen durchdringen relativ dicke Schnitte (bis zu 5 Mikrometer), was es ermöglicht, mit dieser Art der Mikroskopie ganze Zellen zu untersuchen.

Gefriermethode - Chipping.

Die Zellen werden bei flüssigem Stickstoff (196°C) in Gegenwart eines Kryoschutzmittels eingefroren und zur Herstellung von Chips verwendet. Spaltungsebenen verlaufen durch die hydrophobe Mitte der Lipiddoppelschicht. Die freigelegte Innenfläche der Membranen wird mit Platin schattiert, und die resultierenden Repliken werden in Scanning-EM untersucht. Anschließend wird, üblicherweise in einer Vakuumkammer, das überschüssige Eis durch Sublimation entfernt. Diese Operation heißt Radierung. Nach dem Ätzen ist das Relief in der Spaltebene schärfer markiert. Erhaltene Probe schattiert, das heißt, eine dünne Schicht Schwermetalle wird auf die Probenoberfläche gesprüht.

Gewebekultur, Mikrorgie.

Zell- und Gewebekulturmethode

besteht darin, Zellen und Gewebe außerhalb des Körpers in künstlichen Nährmedien zu züchten. Die Methode ermöglicht es, die Reaktionen von Zellen auf verschiedene Einflüsse, Mechanismen der Regulation von Proliferation, Differenzierung und Tod zu untersuchen.

Mikrorgie(micrurgia; micr + ergon - Arbeit, Aktion) - eine Reihe methodischer Techniken und technischer Mittel zur Durchführung von Operationen an sehr kleinen Objekten: Einzeller, einzelne Zellen multizellulärer, intrazellulärer Strukturen.

Zelluläres Engineering, das Konzept der Heterokaryon, Hybridisierung.

Heterokaryon- eine somatische Zelle, die als Ergebnis der Fusion von Elternzellen mit haploiden genetisch unterschiedlichen Kernen gebildet wird. Die resultierenden Heterokaryonen führen zu zwei mononuklearen Hybridzellen.

1965 erhielt der englische Wissenschaftler G. Harris erstmals Heterokaryen, die aus Maus- und menschlichen Zellen gebildet wurden.

Hybridisierung ist der Prozess der Bildung oder des Erlangens Hybriden, die auf der Gewerkschaft basiert Genmaterial verschiedene Zellen in einer Zelle

Thema Inhaltsverzeichnis "Methoden zur Isolierung von Bakterien. Mikroskopie. Kulturmedien zur Kultivierung von Bakterien.":

Polarisationsmikroskopie ermöglicht die Aufnahme von ungefärbten anisotropen Strukturen (z. B. Kollagenfasern, Myofibrillen oder mikrobielle Zellen). Das Prinzip des Verfahrens basiert auf der Untersuchung eines Objekts im Licht, das durch zwei in zueinander senkrechten Ebenen polarisierte Strahlen gebildet wird.

Reis. 11-4. Schema eines Fluoreszenzmikroskops.

Interferenzmikroskopie

Interferenzmikroskopie kombiniert die Prinzipien der Phasenkontrast- und Polarisationsmikroskopie. Das Verfahren wird verwendet, um ein kontrastierendes dreidimensionales Bild von ungefärbten Objekten zu erhalten. Das Prinzip der Methode basiert auf der Bifurkation des Lichtstroms im Mikroskop; ein Strahl durchdringt das Objekt, der andere passiert es. Beide Strahlen sind im Okular verbunden und überlagern sich gegenseitig.

Reis. 11-5. Direkte Immunfluoreszenz... Das direkte Verfahren beinhaltet die Verwendung von fluoreszenzmarkiertem AT für das interessierende Ar; AT interagieren mit AR an den Orten ihrer Lokalisierung, wodurch die Markierung sichtbar gemacht werden kann.

Lumineszenzmikroskopie

Lumineszenzmikroskopisches Verfahren basiert auf der Fähigkeit bestimmter Stoffe zu leuchten, wenn sie kurzwelliger Strahlung ausgesetzt werden. In diesem Fall wird die emittierte Lichtwellen länger als die Welle, die das Glühen verursacht. Anders ausgedrückt absorbieren fluoreszierende Objekte Licht einer Wellenlänge und emittieren in einem anderen Bereich des Spektrums (Abbildung 11-4). Wenn beispielsweise die induzierende Strahlung blau ist, kann das resultierende Leuchten rot oder gelb sein. Diese Stoffe (Fluorescein-Isocyanat, Acridinorange, Rhodamin etc.) werden als Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, um fluoreszierende (lumineszierende) Objekte zu beobachten. In einem Fluoreszenzmikroskop passiert das Licht einer Quelle (Quecksilberhochdrucklampe) zwei Filter.

Reis. 11-6. Indirekte Immunfluoreszenz... Bei der indirekten Methode werden zwei verschiedene ATs verwendet. Die ersten ATs reagieren mit dem Ag des Mikroorganismus, die zweiten ATs (verbunden mit dem Marker) interagieren spezifisch mit den ersten ATs, die Ag zum zweiten AT sind. Das Verfahren ist wesentlich empfindlicher als die direkte Immunfluoreszenz, da an jedes Molekül des ersten AT mehrere Moleküle des zweiten AT binden.

Erster (blauer) Filter fängt Licht vor der Probe ein und lässt Licht einer Wellenlänge durch, die die Fluoreszenz der Probe anregt. Das zweite (gelb) fängt blaues Licht ein, lässt jedoch gelbes, rotes und grünes Licht durch, das von einem fluoreszierenden Objekt emittiert und vom Auge wahrgenommen wird. Üblicherweise werden die untersuchten Mikroorganismen direkt oder mit AT oder mit Fluorochrom markierten Lektinen gefärbt. Die Wirkstoffe interagieren mit Ag oder anderen Liganden-bindenden Strukturen des Objekts. Lumineszenzmikroskopie fanden breite Anwendung für die Visualisierung der Ergebnisse immunchemischer Reaktionen, die auf der spezifischen Wechselwirkung von mit Fluoreszenzfarbstoffen markiertem AT mit Ar des untersuchten Objekts beruhten. Varianten Immunfluoreszenzreaktionen sind in Abb. 11-5 und 11-6.