Beim Kochen Nährmedien Es ist notwendig, den Bedarf der kultivierten Mikroorganismen an verschiedenen Nährstoffen zu berücksichtigen. Es gibt verschiedene Klassifizierungen von Kulturmedien.
Einteilung der Kulturmedien nach Zusammensetzung:
1. Einfache Umgebungen(MPB, MPA, Gelatine, Peptonwasser). Fleisch-Pepton-Brühe (BCH) ist die Proteinbasis aller Medien.
Es gibt mehrere Möglichkeiten, BCH zuzubereiten:
a) in Fleischwasser unter Zusatz von gebrauchsfertigem Pepton;
b) bei Aufschlüssen von Hydrolyseprodukten des Ausgangsmaterials unter Verwendung von Enzymen.
Fleisch-Pepton-Agar (MPA) – wird durch Zugabe von Agar-Agar (1,5-3%) zum MPB erhalten. Wird das MPA entlang der Diagonale eines Reagenzglases oder Fläschchens verteilt, handelt es sich um einen Schrägagar. Wird das Medium vertikal in einem Reagenzglas mit einer Höhe von 5-7 cm verteilt, handelt es sich um Agar in einer Säule. MPA, eingefroren in Petrischalen in Form eines Stick-Platten-Agars. Wenn das Medium eine vertikale Schicht mit einer Höhe von 2-3 cm hat und die diagonale Schicht die gleiche Größe hat, handelt es sich um einen halb ausgekleideten Agar.
2. Komplexe Umgebungen werden auf der Basis von einfachen mit bestimmten Zusatzstoffen (Kohlenhydrate, Blut, Galle, Eier, Molke, Milch, Salze, Wachstumsfaktoren usw.)
Klassifizierung von Nährmedien nach Ausgangskomponenten:
1. Natürliche Nährmedien Ist ein Naturprodukt tierischen oder pflanzlichen Ursprungs.
Kann sein:
Gemüse (Ausgangsprodukte - Sojabohnen, Erbsen, Kartoffeln, Karotten usw.).
Tiere (Ausgangsprodukte - Fleisch, Fisch, Eier, Milch, tierische Gewebe, Galle, Blutserum usw.).
Gemischt (MPA, Lowenstein - Jensen Umgebung, etc.).
2. Künstliche Umgebungen enthalten verarbeitete Naturprodukte (Fleischwasser, Verdauungsprodukte), daraus abgeleitete Stoffe (Pepton, Hefe- und Maisextrakte) und verschiedene Zusatzstoffe. Dies ist die größte und vielfältigste Zusammenstellung der am häufigsten verwendeten Mediengruppe. Sie werden nach bestimmten Rezepturen aus verschiedenen Aufgüssen oder Abkochungen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs unter Zusatz von anorganischen Salzen, Kohlenhydraten und stickstoffhaltigen Substanzen zubereitet.
3. Synthetische Medien(berühmt chemische Zusammensetzung) bestehen aus chemisch reinen Verbindungen in genau definierten Konzentrationen (mit Zusatz von Kohlenhydraten, Salzen, Aminosäuren, Vitaminen etc.). Auf der Grundlage dieser Umgebungen werden durch Hinzufügen natürlicher oder künstlicher Umgebungen halbsynthetische Umgebungen erhalten.
Klassifizierung von Nährmedien nach Konsistenz: Mittwochs ist flüssig(Medien ohne Agar), Halbflüssig(mit Agar bis zu 1%), dicht(Agar - 1,5-2,5%). Flüssige Medien werden häufiger verwendet, um die physiologischen und biochemischen Eigenschaften von Mikroorganismen zu untersuchen, um Biomasse und Stoffwechselprodukte anzureichern. Halbflüssige Medien werden normalerweise zum Aufbewahren von Kulturen verwendet, dichten - zum Isolieren von Mikroorganismen, zum Studium der Morphologie von Kolonien, zu diagnostischen Zwecken, zur quantitativen Erfassung, zur Bestimmung antagonistischer Eigenschaften usw.
Einteilung der Kulturmedien nach Verwendungszweck: universell (allgemein) und speziell.
Universelle (einfache) Umgebungen. Diese Medien werden für die Kultivierung der meisten relativ unprätentiösen Mikroorganismen verwendet oder dienen als Grundlage für die Herstellung spezieller Medien, denen Blut, Zucker, Milch, Molke und andere Zutaten zugesetzt werden, die für die Vermehrung der einen oder anderen Art von Mikroorganismen erforderlich sind. Diese Gruppe umfasst: MPB - Fleisch-Pepton-Brühe, MPA - Fleisch-Pepton-Agar, MPG - Fleisch-Pepton-Gelatine usw.
Besondere Umgebungen. Entwickelt für die Isolierung und selektive Kultivierung bestimmter Arten von Mikroorganismen, die nicht auf einfachen Medien wachsen.
Es gibt folgende Arten von Spezialmedien: Anreicherungsmedien, Elektiv-, Differentialdiagnostik-, Konservierungs- und Speichermedien.
Bereicherung Medien. Viele Mikroorganismen wachsen nicht auf herkömmlichen Medien, daher werden Kohlenhydrate (Zuckerbrühe oder -agar) oder Proteine (Molke-Agar und -Brühe, Blutagar und -Brühe) hinzugefügt, um den Nährwert des Mediums zu erhöhen. Blutagar oder Blutbrühe wird durch Zugabe von 5-10% erwärmtem sterilem defibriniertem Blut von Widder, Kaninchen, Pferd, Mensch zum Nährmedium gewonnen. Das Medium wird verwendet, um Streptokokken, Pneumokokken und andere Bakterien zu isolieren sowie die hämolytische Aktivität zu untersuchen. Molkebrühe oder Molkeagar werden durch Zugabe von 15-20% Pferde- oder Rinderserum zu einfachen Medien hergestellt.
2. Wahl (Wahl-)Umgebungen. Diese Medien wurden entwickelt, um selektiv einen bestimmten Mikroorganismustyp aus einem Material zu isolieren und anzureichern, das mehrere Mikrobentypen enthält. Bei der Aussaat von Material, das eine Mischung verschiedener Mikroorganismen enthält, tritt zuerst das Wachstum der Arten auf, für die dieses Medium gewählt wird. Die Selektivität des Mediums wird durch die Schaffung optimaler Bedingungen für die Kultivierung bestimmter Mikroben (pH, Eh, Salzkonzentration, Nährstoffzusammensetzung) erreicht, d.h. positive Auswahl. Oder durch Zugabe von Substanzen in die Umwelt, die andere Mikroorganismen hemmen (Galle, hohe Konzentrationen von NaCl, Antibiotika etc.), d.h. negative Auswahl. Diese Gruppe umfasst:
Selenit-Umgebung- ist das beste Anreicherungsmedium für Salmonellen und Ruhrmikroben in der Sonne. Im Medium enthaltenes Natriumselenit stimuliert das Wachstum dieser Bakterien und hemmt das Wachstum der Begleitflora.
Wismutsulfit-Agar - enthält Wismutsalze, brillantgrün. Auf diesem Medium wachsen Salmonellen als schwarze Kolonien. Andere Bakterienarten wachsen auf diesem Medium nicht.
Eigelb-Salz-Agar (YSA) - Medium zur Isolierung von Staphylokokken, enthält bis zu 10 % Natriumchlorid, das die meisten im Material enthaltenen Bakterien unterdrückt. Darüber hinaus ist diese Umgebung auch differenzialdiagnostisch, da die Anwesenheit von Eigelb den Nachweis des Enzyms Lecithinase (Lecitovitellase) ermöglicht, das pathogene Staphylokokken bildet. Lecithinase spaltet Lecithin in Phosphorcholine und wasserunlöslich auf Fettsäure, daher trübt sich die Umgebung der lecithinpositiven Kolonien und es entsteht eine opaleszierende Zone in Form einer „Regenbogenkrone“.
Gallenbrühe elektiv für Salmonellen, deren Vermehrung durch die zugesetzte 10 % Galle stimuliert wird und gleichzeitig das Wachstum begleitender Mikroorganismen gehemmt wird.
Alkalischer Agar oder alkalisches Peptonwasser sie sind elektiv für Cholera-Vibrios, die alkalische Reaktion des Mediums (pH 9,0) verhindert das Wachstum von Cholera-Vibrien nicht, hemmt aber das Wachstum anderer Mikroorganismen. 3-5 Tage F
3. Differentialdiagnoseumgebungen. Differenzialdiagnostische Medien werden verwendet, um eine Art von Mikroorganismen von einer anderen aufgrund ihrer Natur zu unterscheiden enzymatische Aktivität... Die Zusammensetzung dieser Medien wird so gewählt, dass die charakteristischsten Eigenschaften eines bestimmten Mikroorganismus anhand der Eigenschaften seines Stoffwechsels eindeutig identifiziert werden.
Medien zum Nachweis von proteolytischen und hämolytischen mikrobielle Fähigkeiten mit Eiweißstoffen: Blut, Milch, Gelatine etc. Die gebräuchlichsten Medien sind Fleisch-Pepton-Gelatine (MPG), geronnenes Pferdeserum, Milch und Blutagar (CA).
Medien zur Untersuchung der glykolytischen Eigenschaften umfassen drei Hauptkomponenten: eine Nährgrundlage (Brühe, Agar), ein Substrat (ein- und auszuckernde, mehrwertige Alkohole) und einen Indikator zum Nachweis der entsprechenden Enzyme. Der enzymatische Abbau von Substraten führt zu einer pH-Verschiebung und einer Veränderung der Farbe des Mediums. Die gebräuchlichsten Farbmedien mit verschiedenen Kohlenhydraten (zB Bromthymolblau, BP-Indikator). Weit verbreitet sind auch Gissmedien, bei denen Unterschiede in der Fähigkeit, verschiedene Kohlenhydrate zu einer Säure oder Säure und Gas zu fermentieren, berücksichtigt werden.
Zur Differenzierung von Enterobakterien wird Peptonwasser mit einer Reihe verschiedener Kohlenhydrate, Andredes Indikator und Schwimmern verwendet, die den Nachweis der Gasbildung erleichtern und helfen, die pH-Änderung verschiedener Mikroorganismen visuell zu bestimmen. Insbesondere verursacht die Verschiebung zur sauren Seite eine Rötung des Mediums mit Andredes Reagenz oder eine Vergilbung bei Verwendung des Mediums mit Bromthymolblau, während Andredes Indikator und Bromthymolblau bei Alkalisierung die Farbe des Mediums nicht verändern. Beispielsweise werden zur Isolierung von pathogenen Bakterien aus dem Darm Medien verwendet, die es ermöglichen, pathogene Mikroorganismen von den ständigen Bewohnern des Darms zu unterscheiden - Mikroorganismen, die Laktose abbauen.
Diese Umgebung ist die Endo-Umgebung. Die Hauptbestandteile von Endos Medium sind MPA, Lactose und basisches Fuchsin, verfärbt mit Natriumsulfit. Das ursprüngliche Kulturmedium ist hellrosa gefärbt. Bei der Fermentation von Laktose entsteht Acetaldehyd, der mit Sulfit reagiert und bei diesem Vorgang freigesetztes Fuchsin die Kolonien leuchtend rot färbt. Daher bildet Escherichia coli, das Lactose fermentiert, beim Wachsen auf diesem Medium rote Kolonien mit einem metallischen Glanz, und Salmonella und Shigella sind farblos, da sie keine Lactose fermentieren.
4. Umgebung der Akkumulation, auf denen bestimmte Arten von Mikroorganismen schnell wachsen.
5. Konservative (Transport-)Medien. Entwickelt, um Mikroorganismen während des Transports zum Forschungsstandort zu konservieren. Diese Medien enthalten Zusatzstoffe, die die Vermehrung und den Tod von Mikroben verhindern, was zur Erhaltung ihrer Lebensfähigkeit beiträgt. Die am häufigsten verwendeten sind Glycerinmischung (Teague's Medium), Phosphat-gepufferte Mischung und Kari-Blair's, Amies' Medien (mit und ohne Aktivkohle), Stewart usw.
Sterilisation von Kulturmedien.
Alle Nährmedien werden unabhängig von ihrem Verwendungszweck in saubere Schalen gefüllt und sterilisiert. Die meisten Medien werden durch Autoklavieren sterilisiert, jedoch unter unterschiedlichen Bedingungen, abhängig von ihrer Zusammensetzung.
1. Synthetische Medien und alle Agarmedien, die kein natives Protein und keine Kohlenhydrate enthalten, werden 15-20 Minuten in einem Autoklaven bei einer Temperatur von 115-120 ° C und einem Druck von 1-1,5 Atmosphären sterilisiert.
2. Medien mit Kohlenhydraten und Milch (die Laktose enthält), werden nahrhafte Gelatine durch fließenden Dampf bei einer Temperatur von 100 ° C fraktioniert oder in einem Autoklaven bei 112 ° C und einem Druck von bis zu 1 Atmosphäre sterilisiert.
3. Medien mit Proteinsubstanzen (Blutserum, Aszitesflüssigkeit) werden durch Tyndalisierung oder Filtration bereitgestellt.
4. Zur Sterilisation von Kulturmedien mit nativen Proteinen wird die Filtration durch Seitz-Membranfilter verwendet.
Um die Sterilität des Mediums nach der Sterilisation zu kontrollieren, wird es 3-5 Tage bei 37 ° C in einen Thermostat gestellt. Flüssige Medien sollten transparent bleiben und es sollten keine Wachstumsspuren auf der Oberfläche und in der Dicke fester Nährmedien auftreten. Neben der Kontrolle der Sterilität wird eine chemische Kontrolle der fertigen Medien durchgeführt, die darin besteht, dass in mehreren Proben jeder Serie der pH-Wert, die Menge an Gesamt- und Aminstickstoff und Chloriden bestimmt werden.
Es gibt auch eine biologische Kontrolle der Medien. In diesem Fall werden mehrere Proben des Mediums mit einer Laborkultur der Mikrobe beimpft, für die das Medium hergestellt wird, und die Art seines Wachstums wird untersucht. Erst nachdem die Medien die Kontrolle bestanden haben, können sie für ihren vorgesehenen Zweck verwendet werden.
1.Nach Zusammensetzung Kulturmedien werden unterteilt in einfach und komplex
Unterscheiden Sie eine Gruppe von Allzweckumgebungen - einfach. Diese Gruppe umfasst Fleisch-Pepton-Brühe (einfache Nährbrühe), Fleisch-Pepton-Agar (einfacher Nähragar), nahrhafte Gelatine. Diese Medien werden verwendet, um viele pathogene Mikroben zu züchten. Allzweckmedien oder einfache Kulturmedien werden normalerweise aus Hydrolysaten unter Zugabe von Pepton und Natriumchlorid hergestellt. Sie dienen auch als Grundlage für die Aufbereitung schwieriger Medien.
Auch hinsichtlich der Zusammensetzung unterscheiden sie sich protein-, proteinfreie und mineralische Medien.
2. Nach Herkunft Umgebungen sind unterteilt in künstlich und natürlich (natürlich).
Natürliche Kulturmedien können Bestandteile tierischen (zB Blut, Serum, Galle) oder pflanzlichen (zB Gemüse- und Obststücke) enthalten.
3.Nach Vereinbarung zuweisen Medien konservieren(für primäre Aussaat und Transport), Anreicherungsumgebungen(für die Ansammlung einer bestimmten Bakteriengruppe), Kulturmedien(universal einfach, komplex speziell und zur Toxinbildung), Medien zur Isolierung und Akkumulation (Konservierung, Anreicherung und Wahl) und Umgebung zur Identifizierung(Differential und Wahl-Differential).
Konservierende Nährmedien verhindern das Absterben von Krankheitserregern und hemmen das Wachstum von Saprophyten. Die am häufigsten verwendeten sind Glycerinmischung, hypertonische Lösung, Glycerinkonservierungsmittel mit LiCl 2, Natriumcitratlösung und Natriumdesoxycholat.
Anreicherungsmedien für Bakterien
Anreicherungsmedien(z. B. Kitta-Tarozzi-Medium, Selenit-Brühe, Thioglykol-Medium) wird verwendet, um eine bestimmte Gruppe von Bakterien anzureichern, indem Bedingungen geschaffen werden, die für einige Arten optimal und für andere ungünstig sind. Am häufigsten werden als solche Mittel verschiedene Farbstoffe und Chemikalien verwendet - Gallensäuresalze, Na + Tetrathionat, Tellurit K, Antibiotika, Fuchsin, Gentianaviolett, Brillantgrün usw.
Ebenfalls nach Vereinbarung zwischen Umgebungen unterscheiden Wahl-, Spezial- und Differentialdiagnostik.
Wahlmedien (selektiv, selektiv, Akkumulation, Anreicherung). Das Prinzip der Erzeugung von Wahlnährböden beruht auf der Befriedigung des biochemischen und energetischen Grundbedarfs der Mikrobenart, für deren Kultivierung sie bestimmt sind, oder auf der Zugabe von Inhibitoren, die das Wachstum der begleitenden Mikroflora unterdrücken. Eine bestimmte Zusammensetzung und Konzentration von Nährstoffen, Spurenelementen, Wachstumsfaktoren bei einem genau definierten pH-Wert oder die Zugabe von Inhibitoren bieten optimale Bedingungen für das Wachstum einer oder mehrerer Arten von Mikroorganismen. Bei der Aussaat von Material, das eine Mischung verschiedener Mikroben enthält, tritt zuerst das Wachstum der Arten auf, für die die Umgebung gewählt wird. Ein Beispiel Wahlfächer sind Gallenbrühe, Selenitbrühe, Ploskirev-Medium - für das Wachstum von Mikroben der Darmfamilie, alkalisches Peptonwasser - für Cholera-Vibrio.
Gallenbrühe... Dem BCH werden 10-20% Rindergalle zugesetzt. Galle hemmt das Wachstum von Koka- und Luftflora, ist aber für die Vermehrung von Salmonellen günstig.
Selenit-Brühe... Besteht aus Phosphatbrühe mit Zusatz von Natriumselenitsalz, das das Wachstum der Kokkenflora, Escherichia coli, hemmt, aber das Wachstum von Salmonellen nicht hemmt.
Mittwoch Ploskirev... Eine dichte Umgebung mit Inhibitoren von Escherichia coli, Coca, aber günstig für das Wachstum von Shigella und Salmonella, deren Fortpflanzung nicht durch Brillantgrün und Gallensalze gehemmt wird.
Peptonwasser... Enthält 1% Pepton und 0,5% Natriumchlorid. Die Umgebung ist für Vibrio cholerae elektiv, weil sie vermehren sich besser als andere Bakterien auf "hungernder Umgebung", insbesondere mit einer alkalischen Reaktion, weil sie selbst saure Abfallprodukte absondern.
Besondere Umgebungen. Notwendig für die Kultivierung von Bakterien, die nicht auf einfachen Nährmedien wachsen. Für manche Organismen ist es notwendig, einfachen Nährmedien Kohlenhydrate, Blut und andere zusätzliche Nährstoffe zuzusetzen. Beispiele für einfache Kulturmedien sind Zuckerbrühe und Zuckeragar für Streptokokken (hergestellt aus MPB bzw. MPA, denen 0,5-2% Glucose zugesetzt wird).
Differentialdiagnoseumgebungen verwendet, um die Spezies der untersuchten Mikrobe auf der Grundlage der Eigenschaften ihres Stoffwechsels zu bestimmen. Differenzialdiagnostische Umgebungen werden nach ihrem Zweck wie folgt unterteilt:
1. Umgebung für die Erkennung proteolytische Fähigkeit Mikroben, die Milch, Gelatine, Blut usw. enthalten.
2. Medien mit Kohlenhydraten und mehrwertigen Alkoholen zum Nachweis verschiedener saccharolytische Enzyme.
Die folgenden Indikatoren werden in die Zusammensetzung von differenzialdiagnostischen Medien zur Identifizierung von saccharolytischen Eigenschaften und Redoxenzymen eingeführt: Neutralrot, Säurefuchsin, Bromthymolblau, Wasserblau mit Rosolsäure (BP). Der Indikator ändert seine Farbe bei verschiedenen pH-Werten und zeigt das Vorhandensein eines Enzyms und den Abbau des in das Medium eingebrachten Inhaltsstoffs an.
Beispiele für differenzialdiagnostische Umgebungen:
Mittwoch Endo... Besteht aus MPA mit Zusatz von 1% Lactose und basischem Fuchsin, verfärbt mit Natriumsulfit (Indikator). Endo-Medium hat eine leicht rosa Farbe. Es wird bei der Diagnose von Darminfektionen verwendet, um Bakterien, die Laktose abbauen, um saure Produkte zu bilden, von Bakterien zu unterscheiden, die diese Fähigkeit nicht haben. Kolonien von Laktose-positiven Mikroben (Escherichia coli) sind aufgrund der Reduktion von Fuchsin rot. Kolonien von laktosenegativen Mikroorganismen - Salmonellen, Shigella und andere - sind farblos.
Differentialdiagnoseumgebungen umfassen kurze und ausgedehnte bunte Reihe... Es besteht aus Medien mit Kohlenhydraten (Giss-Medien), MPB, Milch, Mesopatami-Gelatine.
Giss Mittwoch werden auf Basis von Peptonwasser hergestellt, dem chemisch reine Mono-, Di- oder Polysaccharide (Glukose, Laktose, Stärke etc.) zugesetzt werden.
Dem Medium wird ein Indikator zugesetzt, um pH-Verschiebungen als Folge der Säurebildung und des Kohlenhydratabbaus zu erkennen. Bei einem tieferen Kohlenhydratabbau entstehen gasförmige Produkte (CO 2, CH 4 usw.), die mit Schwimmern – kleinen Reagenzgläsern, die kopfüber in das Medium abgesenkt werden – aufgefangen werden. Medien mit Kohlenhydraten können hergestellt und dicht sein - unter Zugabe von 0,5-1% Agar-Agar. Dann wird die Gasbildung durch die Bildung von Blasen (Brüche) in der Säule des Mediums aufgefangen.
Auf dem zur bunten Reihe gehörenden BCH finden sich Produkte, die beim Abbau von Aminosäuren und Peptonen entstehen (Indol, Schwefelwasserstoff). Schwefelwasserstoff wird nachgewiesen, indem nach dem Animpfen der Kultur ein mit einer Bleiacetatlösung imprägnierter Filterpapierstreifen in den MPB gelegt wird. Bei der Spaltung schwefelhaltiger Aminosäuren wird Schwefelwasserstoff freigesetzt, das Blatt Papier wird durch die Bildung von Bleisulfid schwarz. Zur Bestimmung indol Sie können einen komplexen Indikator verwenden. Indol wird durch den Abbau von Tryptophan gebildet und kann nachgewiesen werden, wenn dieser Indikator einer auf BCH gezüchteten Kultur zugesetzt wird. In Gegenwart von Indol wird MPB grün oder blau.
In praktischen bakteriologischen Labors, Mikro- und Expressmethoden für eine ungefähre Untersuchung der biochemischen Eigenschaften von Mikroorganismen. Hierfür gibt es viele Testsysteme. Das am häufigsten verwendete System von Indikatorpapieren (FEDER). NIBs sind Filterpapierscheiben, die mit Zuckerlösungen oder anderen Substraten in Kombination mit Indikatoren imprägniert sind. Solche Scheiben werden in ein Reagenzglas mit einer in einem flüssigen Nährmedium gezüchteten Kultur eingetaucht. Die Farbänderung der Scheibe mit dem Substrat wird verwendet, um die Arbeit des Enzyms zu beurteilen. Mikrotestsysteme zur Untersuchung der Identifizierung von Enterobacteriaceae werden durch Einweg-Kunststoffbehälter mit Medien mit verschiedenen Substraten unter Zusatz von Indikatoren dargestellt. Die Aussaat einer Reinkultur von Mikroorganismen in solchen Testsystemen ermöglicht es Ihnen, schnell die Fähigkeit von Bakterien zu erkennen, Citrate, Glucose, Saccharose zu verwerten, Ammoniak, Indol freizusetzen, Harnstoff, Lysin, Phenylalanin usw.
Rinderbrühe und Rinderagar sind die einfachsten Nährmedien, die für die meisten Bakterien geeignet sind. Ausgangsmaterial für die Herstellung dieser und einer Reihe anderer Nährmedien ist Fleischwasser, eine gelblich-transparente, sauer reagierende Flüssigkeit. Fleischwasser enthält lösliche Eiweißstoffe (Albumin), Extrakte und einige Salze.
Fleischwasser und konzentrierte Mesopatamia-Brühe (gemäß GOST 10444-63)
Rind- oder Pferdefleisch wird nach dem Entfernen von Knochen, Fett und Sehnen durch einen Fleischwolf geführt und das Hackfleisch mit kaltem Leitungswasser übergossen, wobei 1 Liter Wasser pro 500 g Hackfleisch gegossen wird. Nach dem Rühren wird die Mischung langsam zum Kochen gebracht und 1,5 Stunden mäßig gekocht.Eine kleine Menge einer Mischung aus Hackfleisch und Wasser (bis zu 5 Liter) kann über offenem Feuer unter häufigem Rühren gekocht werden, damit kleine Fleischstücke verbrennen nicht.
Es ist besser, große Mengen in Kesseln mit Dampfmantel zu kochen. Die Bereitschaft von Fleischwasser wird bestimmt, indem eine kleine Menge davon durch einen Papierfilter in ein Reagenzglas gefiltert wird. Ist das Filtrat klar, ist das Fleischwasser fertig. Stellt sich heraus, dass das Filtrat trüb ist, sollte so lange gekocht werden, bis ein vollständig transparentes Filtrat erhalten wird. Nach dem Ende des Garvorgangs wird die Flüssigkeit durch ein Tuch oder eine doppelt gefaltete Gaze gefiltert, der gesamte Saft wird aus dem gekochten Fleisch gepresst und die resultierende Flüssigkeit wird mit gekochtem Wasser auf das ursprüngliche Volumen gebracht. Die Zugabe von viel Wasser ist in der Regel nicht erforderlich, da durch das Garen viel Saft aus dem Fleisch in das Fleischwasser übergeht. Nur bei zu langem Kochen und sehr heftigem Kochen wird eine starke Verdunstung der Flüssigkeit beobachtet.
Das resultierende Fleischwasser wird in Halblitergläser gegossen, aufgerollt und im Autoklaven 20 Minuten bei einer Temperatur von 120 ° C sterilisiert. Aus dem so gewonnenen Fleischwasser werden bedarfsgerecht die notwendigen Nährmedien aufbereitet.
Um eine konzentrierte Mesopatamia-Brühe (MPB) zu erhalten, werden 10 g Pepton1 und 5 g Natriumchlorid zu 1 Liter Fleischwasser gegeben. Das Reaktionsmedium wird auf pH 7,0-7,2 gebracht, gekocht, durch einen Papierfilter filtriert, in saubere Reagenzgläser gegossen und mit Wattestopfen verschlossen im Autoklaven 20 Minuten bei einer Temperatur von 120°C sterilisiert.
Verdünnte Mesopatamie-Brühe
Die Zubereitung von Fleischwasser erfolgt wie bei konzentrierter Brühe, jedoch werden anstelle von 500 g Hackfleisch 250 g davon pro 1 Liter Wasser eingenommen. Sie können das geerntete konzentrierte Fleischwasser mit Wasser halbieren. Zu 1 Liter verdünntem Fleischwasser 5 g Pepton, 2,5 g Natriumchlorid hinzufügen, den pH-Wert auf 7,0-7,2 einstellen und dann genauso vorgehen wie bei der Herstellung von konzentrierter Mesopatamia-Brühe.
Fisch-Pepton-Brühe
In Fabriken, die Fischkonserven herstellen, kann Fischwasser anstelle von Fleischwasser für die Zubereitung von Medien verwendet werden. Fischwasser sollte aus großen, dünnen Fischen zubereitet werden. Am besten eignen sich dafür Zander, Kabeljau oder Hecht. Der von Gräten und Fett befreite Fisch wird durch einen Fleischwolf geführt und mit kaltem Leitungswasser in einer Menge von 1 Liter Wasser pro 500 g gehacktem Fisch übergossen. Alle weiteren Arbeitsschritte zur Zubereitung von Fischwasser sind denen der Zubereitung von Fleischwasser ähnlich.
Fischwasser wird verwendet, um Fischpeptonbrühe zuzubereiten. 10 g Pepton, 5 g Natriumchlorid werden zu 1 Liter Fischwasser gegeben, auf pH 7,0-7,2 neutralisiert und wie Mesopatamia-Brühe sterilisiert.
Die Brühe wird (vor der Sterilisation) durch einen Glastrichter in Reagenzgläser gegossen, an dessen Ende ein Gummischlauch mit Spitze und einer Mohr-Klemme aufgesetzt wird (Abb. 52). Die Glasspitze sollte beim Ausgießen leicht in das Reagenzglas eingetaucht werden, damit die Röhrchenränder nicht mit Brühe benetzt werden, da sonst der Wattebausch auf dem Glas antrocknet und mit Mikroorganismen auskeimen kann.
Ermittlung der Reaktion von Nährmedien
Bei mikrobiologischen Untersuchungen ist es ständig notwendig, die sauren und alkalischen Eigenschaften von Nährmedien zu berücksichtigen. Die aktive Säure des Nährsubstrats hat, wie bereits angedeutet, sehr wichtig v Lebensprozesse Mikroben: Es beeinflusst ihr Wachstum, ihre morphologischen und physiologischen Eigenschaften. Die meisten Bakterien benötigen ein Medium mit einem pH-Wert von 7,2-7,4, für Hefen und Schimmelpilze einen pH-Wert von 4,5-5,5.
Die zur Aufdeckung der biochemischen Eigenschaften von Mikroben hergestellten Nährmedien müssen eine optimale, genau definierte Reaktion für eine bestimmte Mikrobe aufweisen. Der pH-Wert des aufbereiteten Mediums im mikrobiologischen Labor kann entweder elektrometrisch oder kolorimetrisch eingestellt werden. Elektrometrisch wird der pH-Wert mit einem Labor-pH-Meter (zB LP-58 - Abb. 53) oder einem Ionomer (KFV-I1 - Abb. 54) bestimmt.
Zur Messung des pH-Wertes des untersuchten Nährmediums mit einem Ionomer werden ca. 40 ml dieses Mediums in das daran befestigte Glas gegossen, eine Kartusche mit einer Silberchlorid-Halbzelle darin eingetaucht und eine Elektrodenvorrichtung angeschlossen. Die Zeiger des Galvanometers werden ausgelenkt und zeigen den Wert des pH-Wertes an.
Bei Verwendung eines Labor-pH-Meters (LP-58) ist es bequemer, Glas- und Kalomelelektroden zu verwenden. Die Glaselektrodenkugel hat sehr dünne Wände - 0,03-0,05 mm, daher müssen Sie beim Arbeiten damit vorsichtig sein. Vor dem Gebrauch sollte die Glaselektrode mindestens 1-2 Stunden in destilliertem Wasser aufbewahrt werden, und bei häufigem Gebrauch sollte sie ständig in destilliertem Wasser aufbewahrt und regelmäßig durch frisches Wasser ersetzt werden.
Vor der pH-Messung mit einer Glaselektrode wird die pH-Skala mit einer Pufferlösung justiert. Der pH-Wert der Pufferlösung sollte nahe dem pH-Wert der Testlösung liegen. Der Temperaturkompensator des Gerätes wird auf die Temperatur der Pufferlösung eingestellt und der Verstärker und der potentiometrische Teil des Gerätes werden entsprechend dem Normalelement eingestellt. Dann, nachdem Sie die Elektroden und das Messgefäß mit destilliertem Wasser gespült haben, füllen Sie es mit dem Testmedium und messen Sie den pH-Wert des Mediums; Stellen Sie den Temperaturkompensator auf die Temperatur des Mediums ein und drücken Sie die Taste zum Einschalten des Geräts auf der Vorderseite des pH-Meters, beachten Sie die Messwerte des Galvanometerpfeils auf der pH-Skala. Die Regeln für den Gebrauch, die Einstellung und die Wartung der Geräte sind in der den Geräten beiliegenden Anleitung ausführlich beschrieben. Die Dauer der Analyse beträgt 3-5 Minuten. Die Ergebnisse sind ziemlich genau.
Elektrometrisch mit einem pH-Meter und Ionomer ist es sehr praktisch, den pH-Wert von fertigen Medien zu überprüfen. Und da bei der Herstellung von Nährsubstraten für bakteriologische Analysen nicht nur der vorhandene pH-Wert des Mediums fixiert, sondern auch die Reaktion auf einen bestimmten Wert gebracht werden muss, erwies sich die kolorimetrische Methode in der Praxis als bequemer.
Die kolorimetrische Methode basiert auf der Eigenschaft von Indikatoren, ihre Farbe mit einer Änderung der Konzentration von Ionen von H-Lösungen zu ändern. Jeder Indikator hat seinen eigenen pH-Bereich, innerhalb dessen sich seine Farbe ändert. Nach GOST 10444-63 wird eine 0,04%ige Lösung von Bromthymolblau verwendet, um den pH-Wert von Nährmedien einzustellen. Bromthymolblau-Bereich 6,0-7,6. In sauren Umgebungen wird es gelb, in alkalischen - blau. Bei pH 7,1 ergibt es eine hellgrüne Farbe.
Um die Reaktion des Mediums oder der Konserven nach der Entwicklung von Mikroorganismen darin zu bestimmen, wird eine 0,04-prozentige Lösung von Bromcresolpurpur verwendet. Bromkresolpurpur verfärbt sich im pH-Bereich von 5,2-6,3. In sauren Medien ist es blassgelb, in neutralen Medien rotviolett und bei pH 6,3 ergibt es eine grüne Farbe mit einem violetten Farbton.
Die Indikatoren werden wie folgt hergestellt: 0,1 g des entsprechenden Indikators, eingewogen auf einer Analysenwaage, werden in einem Mörser (vorzugsweise Achat) mit 1/20 N vermahlen. Natriumhydroxidlösung. Um 0,1 g Bromthymolblau aufzulösen, nehmen Sie 3,2 ml 1/20 N. NaOH-Lösung; zum Auflösen von 0,1 g Bromcresolpurpur - 3,7 ml 1/20 N. alkalische Lösung. Zu der resultierenden alkalischen Lösung fügen Sie 250 ml destilliertes Wasser hinzu und erhalten eine 0,04 % Indikatorlösung. Die zubereitete Indikatorlösung sollte in Glasgefäßen mit eingeschliffenem Stopfen kühl gelagert werden.
Vor der Sterilisation wird der pH-Wert des Mediums auf das erforderliche Niveau (7,0-7,2) eingestellt. Gießen Sie dazu 1,5 Liter des vorbereiteten Nährmediums in einen großen Kolben (2-3 Liter). Aus der Bürette eine 10%ige Lösung von Natriumbicarbonat oder schwache Lösung Alkali (z. B. 0,1 N Natronlauge), wobei die Reaktion des Mediums ständig durch den Indikator (in diesem Fall durch Bromthymolblau) überprüft wird. Dazu werden einige Tropfen Medium auf weiße Feinsteinzeugfliesen (auch gefliest) aufgetragen und mit einem Tropfen Indikator versetzt. Wenn Bromthymolblau gleichzeitig eine gelbe Farbe ergibt, muss die Zugabe von Soda oder Alkali fortgesetzt werden, bis das Medium aus dem Indikatortropfen hellgrün wird. Erscheint bei Zugabe des Indikators in einem Tropfen des Prüfmediums ein grün-blauer Ton, so wird bei der Titration die Lauge im Überschuss aufgegossen und ein frisches, noch nicht titriertes Nährmedium in den Kolben mit dem Medium gegeben und die Reaktion sollte noch einmal überprüft werden.
Bewährt in der Praxis mit Komparator und Standard-Michaelis-Skala. Diese Methode ist ziemlich genau - die Reaktion des Mediums wird auf 0,1 pH-Einheiten bestimmt. Um den pH-Wert des Mediums mit einem Michaelis-Gerät zu bestimmen, muss zunächst die Reaktion des Mediums mit Lackmuspapier überprüft werden, um zu wissen, welcher Indikator und welche Ampullenreihe aus dem Michaelis-Gerät verwendet werden soll. Da die meisten Nährmedien eine neutrale und leicht alkalische Reaktion erfordern (pH 7,0-7,2), sollten der Methanitrophenol-Indikator und einige Ampullen mit einem pH-Wert von 6,8-8,2 aus dem Gerät entnommen werden. Während der Sterilisation sinkt der pH-Wert des Substrats normalerweise um 0,2 Einheiten. Um optimale Bedingungen für das Wachstum von Mikroorganismen vor der Sterilisation zu schaffen, sollte das vorbereitete Medium daher einen pH-Wert von 7,2-7,4 aufweisen.
Nachdem Sie die Reaktion des Mediums durch Lackmus überprüft und den Indikator ausgewählt haben, nehmen Sie einen Komparator, installieren Sie Reagenzgläser und Standardampullen mit dem entsprechenden pH-Wert (Abb. 55). In das zweite Reagenzglas der ersten Reihe (Nr. 2) im Komparator gießen 2 ml des untersuchten Nährmediums; Hier werden 4 ml destilliertes Wasser und 1 ml einer 0,3%igen Lösung des ausgewählten Indikators (meist, wie bereits erwähnt, Methanitrophenol) zugegeben. In zwei extreme Reagenzgläser der ersten Reihe Nr. 1 und 3 werden 2 ml Nährmedium und 5 ml destilliertes Wasser gegossen. In das mittlere Reagenzglas der zweiten Reihe Nr. 5 werden nur 7 ml destilliertes Wasser gegeben. In die beiden äußersten Buchsen der zweiten Reihe des Komparators Nr. 4 und 6 werden Ampullen mit einer Standardlösung mit pH-Indizes eingesetzt, in deren Intervall sich die Reaktion des Mediums einstellt.
Untersuchen Sie die Reagenzgläser so, dass sie durch das untere Loch im Komparator vor dem Hintergrund einer weißen matten Platte leuchten, und vergleichen Sie die Farbe der Testflüssigkeit mit der Farbe des Indikators. Wenn die Farbe im Reagenzglas mit Medium mit der Farbe des Indikators in einer der Ampullen übereinstimmt, entspricht der pH-Wert des Mediums dem pH-Wert dieser Standardampulle. Wenn sich die Farbe des Testmediums (im zweiten Reagenzglas) als heller als in einer Standardampulle herausstellt, wird eine 10%ige Natriumbicarbonatlösung oder 0,1 N tropfenweise mit dem Medium in das Reagenzglas gegeben. Natronlauge mit einer Mikrobürette zu diesem Zweck. Die tropfenweise Zugabe von Neutralisationslösungen wird fortgesetzt, bis die Farbe im Reagenzglas der Farbe in einer der Ampullen entspricht. Aus der Anzahl der Milliliter Soda oder Alkali, die zur Neutralisation von 2 ml des Mediums (in Reagenzglas Nr. 2) verbraucht wurden, lässt sich leicht berechnen, wie viele Milliliter Neutralisationslösung benötigt werden, um den pH-Wert im gesamten Volumen zu bestimmen des vorbereiteten Nährbodens.
In sehr sauren Medien wird der pH-Wert mit einem para-Nitrophenol-Indikator gemessen. Die Lösungen der verwendeten Indikatoren werden wie folgt hergestellt.
1. 0,3 g meta-Nitrophenol werden in 100 ml destilliertem Wasser (pH-Bereich von 6,8 bis 8,4) gelöst.
2. 0,1 g para-Nitrophenol werden in 100 ml destilliertem Wasser (pH-Bereich von 5,4 bis 7,0) gelöst.
Mit einem Universalindikator können Sie auch den ungefähren pH-Wert des Mediums einstellen. Gießen Sie dazu 2-3 ml des Testmediums in eine Porzellantasse und fügen Sie 2-3 Tropfen eines Universalindikators hinzu. Nachdem Sie die Mischung mit einem Glasstab gerührt haben, vergleichen Sie ihre Farbe mit der Farbe der Streifen auf einer farbigen Papierskala. Der pH-Wert des Testmediums entspricht dem auf dem gleichfarbigen Streifen der Farbskala angegebenen Wert. Die Genauigkeit der pH-Bestimmung mit einem Universalindikator beträgt etwa 0,5.
Herstellung von Mesopatamia-Agar (MPA)
Agar (auf Malaiisch "Gelee") ist eine komplexe organische Substanz, die aus Algen gewonnen wird. In Bezug auf die chemische Zusammensetzung handelt es sich um eine Mischung von Kohlenhydraten, die mit Polysacchariden - Derivaten der Galaktose - verwandt sind und eine Gelierfähigkeit aufweisen. Agar, der dem flüssigen Medium zugesetzt wird, verleiht ihm eine solche Dichte, dass es erst am Siedepunkt schmilzt. Agar schmilzt in Wasser bei ca. 80-86°C, erstarrt bei 36-40°C. Aus diesem Grund können mikrobielle Kulturen auf Agarmedien bei jeder Temperatur gezüchtet werden, die ihr Leben zulässt.
Fleisch-Pepton-Agar wird aus konzentrierter Rinder-Pepton-Brühe hergestellt. In einen großen Erlenmeyerkolben aus feuerfestem Glas mit einem Fassungsvermögen von bis zu 2 Litern, ausgestattet mit einem Wattestopfen, konzentrierte Mesopatamia-Brühe einfüllen, 2 bis 4% (je nach Sorte) fein gehackten Agar hinzufügen und ohne den Stopfen zu schließen , auf niedrige Hitze stellen, um zu schmelzen.
Fleisch-Pepton-Brühe muss mit einer Reaktion des Mediums von 7,4 eingenommen werden, da während der Sterilisation der pH-Wert um 0,2 sinkt. Die Reaktion von Mesopatamia-Agar kann nach vollständigem Schmelzen festgestellt werden. Wenn Agar gute Qualität und gibt keinen Niederschlag, dann wird es nach Einstellung des pH-Wertes 12-15 Minuten gekocht, durch Watte filtriert und in Flaschen oder Reagenzgläser (je nach Bedarf) gegossen, 20 Minuten bei 120 ° C im Autoklaven sterilisiert °C.
Wenn Agar nicht ausreichend gereinigt wird, kann es ausfallen. In diesem Fall sollte Mesopatamia-Agar vor der Sterilisation geklärt werden. Dazu wird Eiweiß mit 30 ml Wasser vermischt und geschlagen, bis Schaum auf den geschmolzenen und auf 50 °C abgekühlten Mesopatamia-Agar gegeben wird. Nehmen Sie für 1 Liter Medium das Protein eines Hühnerei. Agar wird mit dem eingebrachten Protein gründlich geschüttelt und für 10 min bei 120°C in einen Autoklaven gegeben. Während des Kochens koaguliert das Protein und trägt alle Schwebeteilchen mit sich. Nach dem Autoklavieren wird der Agar durch einen Baumwollgazefilter filtriert. Nehmen Sie dazu einen Glastrichter mit großem Durchmesser, ziehen Sie Gaze darüber und legen Sie eine dünne Schicht Watte darauf. Es ist notwendig, den kochenden Agar schnell zu filtrieren und das Filtrat in 5-10 ml Reagenzgläser zu gießen, bis es fest wird. Das Medium wird wie oben beschrieben in einem Autoklaven sterilisiert.
Nach der Sterilisation werden Röhrchen mit Medium mit 5 ml Agar schräg gestellt, damit der Agar den Stopfen nicht berührt. Nach der Verfestigung wird ein "slant" (oder slant) Agar erhalten. Röhrchen mit 10 ml Agar werden in ein Gestell gestellt und erstarren gelassen, wobei ein in eine "hohe Säule" gegossenes Medium aufgenommen wird. Es wird nicht empfohlen, Schrägagar länger als 4-7 Tage zu lagern, da er austrocknet.
Fleisch-Pepton-Agar ist das Hauptnährmedium für bakteriologische Analysen in mikrobiologischen Labors. Es wird sowohl in Form von "einfachem Agar" als auch nach Zugabe von Kohlenhydraten zur Herstellung komplexer differenzialdiagnostischer Medien verwendet.
Die Notwendigkeit der Kultivierung von Mikroben ist nicht nur mit dem Zweck verbunden, den Erreger der Krankheit aus dem Testmaterial zu isolieren und seine Art zu bestimmen, sondern auch mit der Ansammlung mikrobieller Masse bei der Herstellung biologischer Präparate: Impfstoffe, Antigene und Allergene. Für die Kultivierung von Mikroorganismen im Labor werden verschiedene künstliche Nährmedien verwendet.
Nährmedien sind: nach Konsistenz - flüssig, dicht, halbflüssig; nach Herkunft - tierische, pflanzliche und synthetische Medien konstanter Zusammensetzung; nach Vereinbarung - gewöhnlich oder einfach für die Kultivierung der meisten Mikroorganismen; speziell - zur Kultivierung von Mikroben, die auf herkömmlichen Nährmedien nicht oder schlecht wachsen; Differentialdiagnostik - wird verwendet, um die generischen oder Speziesmerkmale der untersuchten Bakterienkulturen zu bestimmen (hämolytische, saccharolytische, proteolytische, reduzierende und andere Eigenschaften); selektiv - zur Isolierung von Mikroben derselben Gattung oder Art aus dem Material, das die Mischung enthält verschiedene Typen Mikroorganismen, auf denen einige Arten gut wachsen, während andere dies nicht tun; Anreicherungsumgebungen (akkumulativ).
Fleischwasser ist die Grundlage vieler Nährmedien tierischen Ursprungs. Es wird aus frischem, magerem Rindfleisch zubereitet, das von Knochen, Faszien und Sehnen befreit ist. Gehacktes Fleisch (kleine Stücke oder Hackfleisch) wird mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1: 2 (für 1 kg Fleisch, 2 Liter Wasser) gegossen. Es wird 12-24 Stunden extrahiert, 1,5-2 Stunden gekocht, filtriert, destilliertes Wasser wird zum ursprünglichen Volumen hinzugefügt, in Flaschen, Kolben gegossen, mit Baumwollgazestopfen verschlossen und im Autoklaven sterilisiert.
Regelmäßige (einfache) Umgebungen.
Fleisch-Pepton-Brühe (BCH)- ein flüssiges Nährmedium. Zur Herstellung werden 1 Liter Fleischwasser mit 1% Pepton, 0,5% chemisch reinem Natriumchlorid versetzt und gekocht. Fleischwasser ist eine schwach saure Reaktion, daher wird das BCH alkalisch gemacht - eine kleine Menge einer 10-15%igen Lösung von KOH oder NaOH wird hinzugefügt, 2-3 Minuten gekocht, der pH-Wert wird mit einem Michaelns-Komparator überprüft (Abb. 30) oder ein Elektropotentiometer. Die Fleisch-Pepton-Brühe wird durch einen Papierfilter filtriert, in Reagenzgläser gegossen und autoklaviert.
Fleisch-Pepton-Agar (MPA)- dichter Nährboden. 2% Agar-Agar (stickstofffreie organische Substanz aus Algen) wird zum MPB gegeben und bis zum Schmelzen gekocht, der pH-Wert wird heiß eingestellt, 5-10 Minuten gekocht, heiß durch einen Baumwollgazefilter filtriert, in Reagenzgläser oder Konen, autoklavierbar. Nach der Sterilisation werden Heißagarröhrchen in einem Winkel von 5-6 ° schräg gelegt. Beim Erstarren bildet sich eine abgeschrägte dichte Oberfläche.
Fleisch-Pepton halbflüssiger Agar wie MPA vorbereiten; der Unterschied besteht darin, dass weniger Agar hinzugefügt wird - 0,15-0,20-0,25%.
Spezielle Nährmedien.
Bouillon Martin. Schweinemägen (oder Rinderlabomasum) werden von Fett, Faszien gereinigt, in einem Fleischwolf zerkleinert, 1: 4 mit Wasser gefüllt und 1% (nach Volumen der Flüssigkeit) Salzsäure hinzugefügt. Die Mischung wird 24 h bei 50° gehalten, mit einer 20 %igen NaOH-Lösung bis zur Alkalinisierung durch Lackmus neutralisiert und 15 min bei 120° autoklaviert. Um die Brühe zuzubereiten, gleiche Mengen Fleischwasser und die resultierende Mischung mischen, 10 Minuten kochen, mit 20% NaOH-Lösung auf pH 7,9 alkalisieren, 30 Minuten kochen, filtrieren, in Reagenzgläser gießen, bei 0,5 atm (110 ° .) autoklavieren ) 30min.
Die Zugabe von 2% Agar liefert ein dichtes Medium - Martin-Agar.
Hottingers Brühe hergestellt aus tryptischem Hydrolysat (Verdauung) von Fleischabfällen - Faszien, Fett, Sehnen. 0,1 kg Fleischreste werden in 2 Liter kochendes Wasser gegossen, 5 Minuten gekocht, auf 45° abgekühlt und Pankreatin 5,0-10,0 zugegeben, mit Natriumcarbonat auf pH 7,8-8,0 alkalisiert, geschüttelt und Chloroform zugegeben (10 ml) 1 l), fest verschlossen, 10 Tage an einem warmen Ort aufbewahrt, täglich schütteln. Der resultierende Aufschluss wird mit Salzsäure auf pH 5,5 angesäuert. An einem dunklen Ort aufbewahren. Zur Vorbereitung des Nährmediums 100-200 ml des entstandenen Aufschlusses in 1 Liter Wasser geben, 1-2 Minuten kochen, filtrieren, alkalisieren, sterilisieren. Hottinger's Agar wird wie normales MPA hergestellt.
Zucker (Glukose) Brühe (oder Agar) werden wie übliche Medien hergestellt, denen jedoch 1-2% Glucose zugesetzt und mit fließendem Dampf sterilisiert oder bei 0,5 atm autoklaviert werden.
Fleisch-Pepton-Gelatine. 10-20% Gelatine (ein Produkt, das aus klebenden Tiergeweben gewonnen wird) wird dem MPB zugesetzt, geschmolzen und heiß, die gewünschte Reaktion des Mediums wird eingestellt, durch einen Baumwollgazefilter geleitet, in Reagenzgläser gegossen, mit fließendem Dampf sterilisiert fraktioniert.
Fleisch-Pepton-Leberbrühe Kitt - Tarozzi- ein flüssiges Medium für die Kultivierung von Anaerobiern. Die Leber von Rindern wird in kleine Stücke geschnitten, mit Wasser 1: 1 gegossen, gekocht, gefiltert und Leberwasser wird dem MPB 2: 1 (für 2 Liter MPB 1 Liter Leberbrühe) hinzugefügt, gekocht, pH eingestellt, in eine hohe Säule in Röhrchen gegossen, in die gekochte Leberstücke vorgeschüttet wurden. 1-2 ml Vaselineöl werden in Reagenzgläser auf das Medium gegossen und in einem Autoklaven bei 0,5 atm 30 Minuten lang sterilisiert
Molkebrühe und Serum-präziser Fleisch-Pepton-Agar wird durch aseptische Zugabe zu BCH hergestellt oder geschmolzen n auf 45-50° gekühlt MPA 5-10% steriles Pferdeblutserum (oder Widder, Kaninchen), dann wird die Molkebrühe in sterile Röhrchen gegossen ( Flaschen).
Serum MPA gegossen oder in Reagenzgläser (Säule). oder in Petrischalen.
Differentialdiagnoseumgebungen. Blut-MPA wird verwendet, um die hämolytischen Eigenschaften von Bakterien aufzudecken. Zuvor wird Blut aseptisch in einen sterilen Kolben mit Glasperlen (von einem Widder, Pferd oder Kaninchen) entnommen und 15-20 Minuten geschüttelt, um das Fibrin vom Rest des Blutes zu trennen. Fibringerinnsel werden auf Kügelchen aufgebracht und defibriniertes Blut (5-10%) wird dem geschmolzenen und abgekühlten MPA steril zugesetzt, die Zapfen werden durch sanftes Drehen gleichmäßig gemischt und in sterile Petrischalen gegossen.
Mittwoch von Giss. In Peptonwasser (bestehend aus destilliertem Wasser, 0,5% NaCl und 1% Pepton) 0,5% Kohlenhydrat (Zucker oder mehrwertiger Alkohol) und 0,5% Andredes Indikator zugeben. Normalerweise wird ein Satz Medien mit unterschiedlichen Kohlenhydraten hergestellt, jedes separat. Als Indikator werden 0,5 g saures Fuchsin, 16 ml 4 %ige NaOH-Lösung, 100 ml destilliertes Wasser verwendet. Medien mit Kohlenhydraten werden in Reagenzgläser gegossen, wobei "Gasröhren" (Floats) verkehrt herum in Reagenzgläser getaucht werden. Medien mit Kohlenhydraten mit Flüssigdampf fraktioniert sterilisieren. ... Giss-Medien können flüssig und halbflüssig sein - (ohne Gasherde) und enthalten 0,25% Agar. Wenn ein bestimmtes Kohlenhydrat von einer in einer bestimmten Umgebung wachsenden Mikrobe fermentiert wird, wird eine Säure gebildet, unter deren Einfluss die Farbe des Indikatorfarbstoffs wiederhergestellt wird. Das Medium wird rot. Die bei der Vergärung des Kohlenhydrats gebildeten gasförmigen Produkte sammeln sich in den Schwimmern an.
Mittwoch Endo. In geschmolzenem MPA (pH 7,4-7,6) werden 0,5-1 % Lactose und 0,5 % gesättigte alkoholische Lösung von basischem Fuchsin zugegeben, die durch tropfenweise Zugabe von 10 % Natriumsulfat entfärbt wird. Das Medium wird gekocht und in Petrischalen gegossen. Auf diesem Medium wachsen laktosefermentierende Bakterien in Form von roten Kolonien.
Mittwoch Levin. Bereiten Sie 2% Hottinger Broth Agar, pH 7,2-7,4, vor und sterilisieren Sie im Autoklaven. Zu 100 ml gebrauchsfertigem geschmolzenem Agar fügen Sie hinzu: 2 ml einer 0,5%igen Methylenblaulösung, 1,5 ml 2% Eosin (alkalisch bakteriologisch), 2 g Laktose und 0,2 g zweibasiges Kaliumphosphat (NaHPO4). Farbstofflösungen werden in destilliertem Wasser hergestellt und in einer Koch-Apparatur sterilisiert. Eine Methylenblau-Lösung wird vor Gebrauch im Wasserbad erhitzt und in warmer Form dem Agar zugesetzt. Nach Zugabe dieser Komponenten wird das Medium gründlich gemischt und in Petrischalen gegossen. Das Medium ist lila.
Wismutsulfit-Agar(Mittwoch Wilson-Blair). MPA (pH 7,5) mit einem Indikator, der Zitronensäure-Wismut, Natriumsulfat, Mohrsches Salz (Ammoniumsulfat des Eisens), zweibasiges Natriumphosphat, Glucose und Brillantgrün enthält. Derzeit wird Wismut-Sulfit-Agar (wie Endo-Agar, Ploskirevs Medium) von der Industrie in Trockenpulverform hergestellt. 6 g Trockenpulver werden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, unter ständigem Rühren erhitzt, in sterile Reagenzgläser gegossen und schräg stehen gelassen. Sie verwenden auch Medien mit Chemikalien, die aufgrund von Redox-(reduzierenden) Prozessen, die durch bakterielle Enzyme verursacht werden, ihre Farbe ändern. ... Dazu wird Milch mit Methylenblau zubereitet. Frische entrahmte Kuhmilch wird mit Natriumbicarbonat nach Lackmuspapier leicht alkalisch gestellt, eine 1%ige wässrige Lösung von Methylenblau und blauer Farbe wird zugegeben. Mit strömendem Dampf fraktioniert sterilisiert.
Besteht die Vermutung, dass das Testmaterial eine geringe Menge an Bakterien enthält, wird die Verwendung eines Akkumulations-(Anreicherungs-)Mediums empfohlen. Mit Shustova: Dem MPA (pH 7,4) werden 10% 50%ige wässrige Lösung von Hyposulfit und 2% Lugolsche Lösung zugesetzt. Wird zur Ansammlung von Paratyphus-Bakterien verwendet. Mittwoch Rappoport: Addieren Sie 1 % Glukose, 10 % Galle und 1 % Andrades Indikator zum BCH. Sterilisiert mit fließendem Dampf.
Synthetische Medien verwendet, um den Stoffwechsel von Bakterien und andere biologische Merkmale zu untersuchen. Sie bestehen aus chemisch reinen wasserlöslichen Substanzen in genau definierten Mengen: Ammoniumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumchlorid, Magnesiumsulfat, Glukose oder andere Kohlenhydrate, Nicotinamid usw. Dichte synthetische Medien werden nach Bedarf durch Zugabe von Agar hergestellt. Sterilisiert im Autoklaven. (Synthetic Media Model, Sotton
Für die Kultivierung von Hefen und Schimmelpilzen werden folgende Medien verwendet
Van Iterson Synthetisches Medium: Ammoniumnitrat (NaH4NO3) 0,5, Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4) 0,5, Leitungswasser 1 l. Autoklavieren bei 1 ATM für 20 Minuten.
Sabouraud-Glucose-Agar: Glucose 4,0, Pepton 1,0, Agar 1,8, Wasser 100 ml. Sterilisiert durch Autoklavieren.
Litman-Agar mit Rindergalle: Pepton 10,0, Glucose 10,0, dehydrierte Rindergalle 15 ml, Kristallviolett 0,01, Wasser 1 l, Agar 20,0. Sterilisiert in einem Autoklaven bei 1 ATM für 15 Minuten. In einer dicken Schicht in * Tassen gießen, um eine Austrocknung des Mediums zu verhindern.
2. Klassifizierung von Kulturmedien
Bei der Herstellung von Nährmedien muss der Bedarf an kultivierten Mikroorganismen in verschiedenen Nährstoffen berücksichtigt werden. Es gibt verschiedene Klassifizierungen von Kulturmedien.
Einteilung der Kulturmedien nach Zusammensetzung:
1. Einfache Umgebungen(MPB, MPA, Gelatine, Peptonwasser). Fleisch-Pepton-Brühe (BCH) ist die Proteinbasis aller Medien. Es gibt mehrere Möglichkeiten, BCH zuzubereiten:
a) in Fleischwasser unter Zusatz von fertigem Pepton (ein Produkt der unvollständigen Verdauung von Protein) - dies ist die sogenannte Mesopatamia-Brühe;
b) auf den Aufschluss von Hydrolyseprodukten des Ausgangsmaterials unter Verwendung von Enzymen (Trypsin - Hottinger-Brühe, Pepsin - Martin-Brühe).
Fleisch-Pepton-Agar (MPA) - erhalten Sie Arap-Arapa (l, 5-3%) Möglichkeiten der Zugabe zum MPB. Wird das MPA diagonal über das Röhrchen oder Fläschchen verteilt, handelt es sich um einen Schrägagar, wird das Medium vertikal in einem 5-7 cm hohen Röhrchen verteilt, handelt es sich um einen Säulenagar. MPA, verfestigt in Petrischalen in Form eines Platten-Platten-Agars. Wenn das Medium eine vertikale Schicht von 2-3 cm Höhe hat und die diagonale Schicht die gleiche Größe hat, handelt es sich um einen halb ausgekleideten Agar.
2. Komplexe Umgebungen werden auf der Basis von einfachen mit bestimmten Zusatzstoffen (Kohlenhydrate, Blut, Galle, Eier, Molke, Milch, Salze, Wachstumsfaktoren usw.)
Klassifizierung von Nährmedien nach Ausgangskomponenten:
1.Natürliche Nährmedien ist ein Naturprodukt tierischen oder pflanzlichen Ursprungs. Kann sein:
Gemüse (Ausgangsprodukte - Sojabohnen, Erbsen, Kartoffeln, Karotten usw.)
Tiere (Ausgangsprodukte - Fleisch, Fisch, Eier, Milch, tierische Gewebe, Galle, Blutserum usw.)
Gemischt (MPA, Löwenstein - Jensen mittel, etc.)
2. Künstliche Umgebungen enthalten verarbeitete Naturprodukte (Fleischwasser, Verdauungsprodukte), daraus abgeleitete Stoffe (Pepton, Hefe- und Maisextrakte) und verschiedene Zusatzstoffe. Dies ist die größte und vielfältigste Zusammenstellung der am häufigsten verwendeten Mediengruppe. Sie werden nach bestimmten Rezepturen aus verschiedenen Aufgüssen oder Abkochungen tierischen oder pflanzlichen Ursprungs unter Zusatz von anorganischen Salzen, Kohlenhydraten und stickstoffhaltigen Substanzen zubereitet.
3. Synthetische Medien(von bekannter chemischer Zusammensetzung) bestehen aus chemisch reinen Verbindungen in genau definierten Konzentrationen (mit Zusatz von Kohlenhydraten, Salzen, Aminosäuren, Vitaminen etc.). Auf der Grundlage dieser Umgebungen werden halbsynthetische Umgebungen erhalten, indem natürliche oder künstliche Umgebungen hinzugefügt werden.
Klassifizierung von Nährmedien nach Konsistenz: Mittwochs ist flüssig(Medien ohne Agar), Halbflüssig(mit Agar bis zu 1%), dicht(Agar - 1,5-2,5%). Flüssige Medien werden häufiger verwendet, um die physiologischen und biochemischen Eigenschaften von Mikroorganismen zu untersuchen, um Biomasse und Stoffwechselprodukte anzureichern. Halbflüssige Medien werden normalerweise zum Aufbewahren von Kulturen verwendet, dichten - zum Isolieren von Mikroorganismen, zum Studium der Morphologie von Kolonien, zu diagnostischen Zwecken, zur quantitativen Erfassung, zur Bestimmung antagonistischer Eigenschaften usw.
Einteilung der Kulturmedien nach Verwendungszweck: universell (allgemein) und speziell.
Universelle (einfache) Umgebungen. Diese Medien werden für die Kultivierung der meisten relativ unprätentiösen Mikroorganismen verwendet oder dienen als Grundlage für die Herstellung spezieller Medien, wobei Blut, Zucker, Milch, Molke und andere Zutaten hinzugefügt werden, die für die Vermehrung der einen oder anderen Art von Mikroorganismen erforderlich sind. Diese Gruppe umfasst: MPB - Fleisch-Pepton-Brühe, MPA - Fleisch-Pepton-Agar, MPG - Fleisch-Pepton-Gelatine usw.
Besondere Umgebungen. Entwickelt für die Isolierung und selektive Kultivierung bestimmter Arten von Mikroorganismen, die nicht auf einfachen Medien wachsen.
Es gibt folgende Arten von Spezialmedien: Anreicherungsmedien, Elektiv-, Differentialdiagnostik-, Konservierungs- und Speichermedien.
1. Bereicherung Medien. Viele Mikroorganismen wachsen nicht auf gewöhnlichen Medien, daher werden zur Erhöhung des Nährwerts des Mediums Kohlenhydrate (Zuckerbrühe oder -agar) oder Proteine (Molke-Agar und -Brühe, Blut-Agar und -Brühe) hinzugefügt - wird durch Zugabe von 5-10% erwärmtem sterilem defibriniertem Blut von Widder, Pferdekaninchen, Mensch zum Nährmedium erhalten. Das Medium wird verwendet, um Streptokokken, Pneumokokken und andere Bakterien zu isolieren sowie die hämolytische Aktivität zu untersuchen. Molkebrühe oder Molkeagar werden durch Zugabe von 15-20% Pferde- oder Rinderserum zu einfachen Medien hergestellt. Das Medium wird verwendet, um Pneumokokken, Meningokokken zu isolieren.
2. Wahl (Wahl-)Umgebungen. Diese Medien wurden entwickelt, um selektiv einen bestimmten Mikroorganismustyp aus einem Material zu isolieren und anzureichern, das mehrere Mikrobentypen enthält. Bei der Aussaat von Material, das eine Mischung verschiedener Mikroorganismen enthält, tritt zuerst das Wachstum der Arten auf, für die dieses Medium gewählt wird. Die Selektivität des Mediums wird durch die Schaffung optimaler Bedingungen für die Kultivierung bestimmter Mikroben (pH, Eh, Salzkonzentration, Nährstoffzusammensetzung) erreicht, d.h. positive Auswahl. Oder durch Zugabe von Substanzen in die Umwelt, die andere Mikroorganismen hemmen (Galle, hohe Konzentrationen von NaCl, Antibiotika etc.), d.h. negative Auswahl. Diese Gruppe umfasst:
Selenit-Umgebung- ist das beste Anreicherungsmedium für Salmonellen und Ruhrmikroben in der Sonne. Im Medium enthaltenes Natriumselenit stimuliert das Wachstum dieser Bakterien und hemmt das Wachstum der Begleitflora.
Wismutsulfit-Agar- enthält Wismutsalze, brillantgrün. Auf diesem Medium wachsen Salmonellen als schwarze Kolonien. Andere Bakterienarten wachsen auf diesem Medium nicht.
Eigelb-Salz-Agar (YSA)– Medium zur Isolierung von Staphylokokken, enthält bis zu 10 % Natriumchlorid, das die meisten im Material enthaltenen Bakterien unterdrückt. Darüber hinaus ist diese Umgebung auch differenzialdiagnostisch, da die Anwesenheit von Eigelb den Nachweis des Enzyms Lecithinase (Lecitovitellase) ermöglicht, das pathogene Staphylokokken bildet. Lecithinase spaltet Lecithin in Phosphorcholine und wasserunlösliche Fettsäuren auf, sodass die Umgebung der lecithinpositiven Kolonien trüb wird und eine opaleszierende Zone in Form einer „Regenbogenkrone“ erscheint.
Für Salmonellen ist Gallenbrühe wahlfrei, deren Vermehrung durch die zugesetzten 10 % Galle stimuliert wird und gleichzeitig das Wachstum begleitender Mikroorganismen gehemmt wird.
Für Cholera-Vibrios ist alkalischer Agar oder alkalisches Pepton-Wasser wählbar, die alkalische Reaktion des Mediums (pH 9,0) verhindert nicht das Wachstum von Cholera-Vibrien, sondern hemmt das Wachstum anderer Mikroorganismen.
3. Differentialdiagnoseumgebungen. Differenzialdiagnostische Medien werden verwendet, um die biochemischen Eigenschaften und Unterschiede (Differenzierung) eines Mikroorganismustyps von einem anderen durch die Natur ihrer enzymatischen Aktivität zu untersuchen. Die Zusammensetzung dieser Medien wird so gewählt, dass die charakteristischsten Eigenschaften eines bestimmten Mikroorganismus anhand der Eigenschaften seines Stoffwechsels eindeutig identifiziert werden. Die differenzierenden Eigenschaften dieser Medien werden durch die Einführung eines Substrats geschaffen, zu dem das Verhältnis von Mikroben, ihre enzymatische Aktivität und die Wirkung von Toxinen (Giss-Medium, Endo, Levin, Ploskirev, Olkenitsky, Wismut-Sulfit-Agar usw.) bestimmt sind. Differenzialdiagnostische Nährmedien werden nach ihrem Verwendungszweck wie folgt unterteilt:
Medien zum Nachweis der proteolytischen und hämolytischen Fähigkeit von Mikroben, die Proteinsubstanzen enthalten: Blut, Milch, Gelatine usw. Die gängigsten Medien sind Fleisch-Pepton-Gelatine (MPG), geronnenes Pferdeserum, Milch und Blutagar (CA).
Umgebungen mit gleichgültigen Chemikalien, die einigen Arten von Mikroben als Nahrungsquelle dienen und von anderen nicht aufgenommen werden. Zum Beispiel Medien, die Stoffe enthalten, die nur von einer bestimmten Bakteriengruppe aufgenommen werden. Die gebräuchlichsten Medien in dieser Gruppe sind Simmons-Citrat-Agar und Coser-Citrat-Medium.
Medien mit Kohlenhydraten, mehrwertigen Alkoholen oder Indikatoren zum Nachweis der entsprechenden Enzyme und zur Bestimmung der glykolytischen Aktivität von Mikroorganismen. Der enzymatische Abbau von Substraten führt zu einer pH-Verschiebung und einer Veränderung der Farbe des Mediums. Die gebräuchlichsten farbigen Medien mit verschiedenen Kohlenhydraten (z. B. mit Bromthymolblau, BP-Indikator) und Lackmusmilch (Minkevich-Medium). Weit verbreitet sind auch Gissmedien, bei denen Unterschiede in der Fähigkeit, verschiedene Kohlenhydrate zu einer Säure oder Säure und Gas zu fermentieren, berücksichtigt werden. Zur Differenzierung von Enterobakterien wird Peptonwasser mit einer Reihe verschiedener Kohlenhydrate, Andredes Indikator und Schwimmern verwendet, die den Nachweis der Gasbildung erleichtern und helfen, die pH-Änderung verschiedener Mikroorganismen visuell zu bestimmen. Insbesondere verursacht die Verschiebung zur sauren Seite eine Rötung des Mediums mit Andredes Reagenz oder eine Vergilbung bei Verwendung des Mediums mit Bromthymolblau, während Andredes Indikator und Bromthymolblau bei Alkalisierung die Farbe des Mediums nicht verändern. Beispielsweise werden zur Isolierung von pathogenen Bakterien aus dem Darm Medien verwendet, die es ermöglichen, pathogene Mikroorganismen von den ständigen Bewohnern des Darms zu unterscheiden - Mikroorganismen, die Laktose abbauen. Ein solches Medium ist Endo-Medium, das Lactose enthält. Die Hauptbestandteile von Endos Medium sind MPA, Lactose und basisches Fuchsin, verfärbt mit Natriumsulfit. Das ursprüngliche Kulturmedium ist hellrosa gefärbt. Bei der Fermentation von Laktose entsteht Acetaldehyd, der mit Sulfit reagiert und bei diesem Vorgang freigesetztes Fuchsin die Kolonien leuchtend rot färbt. Daher bildet Escherichia coli, das Lactose fermentiert, beim Wachsen auf diesem Medium rote Kolonien mit einem metallischen Glanz, und Salmonella und Shigella sind farblos, da sie keine Lactose fermentieren.
Medien zur Bestimmung der Reduktionsfähigkeit von Mikroorganismen. Zu dieser Gruppe gehören Medien mit Anstrichen, die sich bei Reduktion unter Einwirkung von Redoxenzymen verfärben (z. B. Methylenblau, Säurefuchsin, Bromthymolblau) sowie Medien mit Nitraten zur Bestimmung der denitrifizierenden Aktivität von Bakterien (bei positivem die Medien werden blau) ... Der Indikator ändert seine Farbe bei verschiedenen pH-Werten und zeigt das Vorhandensein oder Fehlen von Spaltung, Oxidation oder Reduktion des in das Medium eingebrachten Inhaltsstoffs an. Der Indikator ist jedoch kein obligatorischer Bestandteil der Medien zum Nachweis von Enzymen. Somit wird die Anwesenheit von Gelatinase und anderen proteolytischen Enzymen in Kultur durch die Verdünnung von Gelatine, gerolltem Ei oder Molkeprotein bestimmt.
4. Umgebung der Akkumulation, auf denen bestimmte Arten von Mikroorganismen schnell wachsen.
5. Konservierungsmedien. Entwickelt, um Mikroorganismen während des Transports zum Forschungsstandort zu konservieren.Diese Medien enthalten Zusätze, die die Vermehrung und den Tod von Mikroben verhindern, was zur Erhaltung ihrer Lebensfähigkeit beiträgt. Die am häufigsten verwendeten sind Glycerinmischung (Teague-Medium), hypertonische Lösung, phosphatgepufferte Mischung.
Sterilisation von Kulturmedien. Alle Nährmedien werden unabhängig von ihrem Verwendungszweck in saubere Schalen gefüllt und sterilisiert. Die meisten Medien werden durch Autoklavieren sterilisiert, jedoch unter unterschiedlichen Bedingungen, abhängig von ihrer Zusammensetzung.
1. Synthetische Medien und alle Agarmedien, die kein natives Protein und keine Kohlenhydrate enthalten, werden 15-20 Minuten in einem Autoklaven bei einer Temperatur von 115-120 ° C und einem Druck von 1-1,5 Atmosphären sterilisiert.
2. Medien mit Kohlenhydraten und Milch (die Laktose enthält), werden nahrhafte Gelatine durch fließenden Dampf bei einer Temperatur von 100 ° C fraktioniert oder in einem Autoklaven bei 112 ° C und einem Druck von bis zu 1 Atmosphäre sterilisiert.
3. Medien mit Proteinsubstanzen (Blutserum, Aszitesflüssigkeit) werden mit Tyndalisierung oder Filtration versehen.
4. Zur Sterilisation von Kulturmedien mit nativen Proteinen wird die Filtration durch Seitz-Membranfilter verwendet.
Um die Sterilität des Mediums nach der Sterilisation zu kontrollieren, wird es 3-5 Tage bei 37 ° C in einen Thermostat gestellt. Flüssige Medien sollten transparent bleiben und es sollten keine Wachstumsspuren auf der Oberfläche und in der Dicke fester Nährmedien auftreten. Neben der Sterilitätskontrolle wird eine chemische Kontrolle von Fertigmedien durchgeführt, die darin besteht, dass in mehreren Proben jeder Serie der pH-Wert, die Menge an Gesamt- und Aminstickstoff und Chloriden bestimmt werden.
Es gibt auch eine biologische Kontrolle der Medien. In diesem Fall werden mehrere Proben des Mediums mit einer Laborkultur der Mikrobe beimpft, für die das Medium hergestellt wird, und die Art seines Wachstums wird untersucht. Erst nachdem die Medien die Kontrolle bestanden haben, können sie für ihren vorgesehenen Zweck verwendet werden.
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