© Sharova N.P., Abramova E.B.
DNA-Schäden und -Reparatur
oder
"Für jedes Loch gibt es einen Patch"
N. P. Sharova, E. B. Abramova
Natalya Petrowna Sharova, Doktor der biologischen Wissenschaften, leitender Forscher am Koltsov-Institut für Entwicklungsbiologie der Russischen Akademie der Wissenschaften.
Elena Borisovna Abramova, Kandidat der biologischen Wissenschaften, leitender Forscher am selben Institut.
Das genetische Programm jedes in der DNA aufgezeichneten Lebewesens – vom einfachsten Einzeller bis zum hochorganisierten Vielzeller – bleibt in der Nachfolge der Nachkommen aufgrund der exakten Reproduktion der Nukleotidsequenz in jeder Generation erhalten. Wenn jedoch das Haupterbmolekül geschädigt wird, und dies sogar spontan, können Veränderungen in seiner Struktur nicht nur zu verschiedenen Pathologien von Geweben oder Organen führen, sondern auch zur Übertragung von Mutationen auf die Nachkommen. Und überraschenderweise ist die DNA das einzige zelluläre Makromolekül, das in der Lage ist, Schäden in seiner eigenen Struktur zu reparieren. Es kodiert sogar Informationen über die Mechanismen jener Prozesse, die an solchen Reparaturen beteiligt sind (in einem streng wissenschaftlichen Umfeld werden sie Reparationen genannt). Es ist die „Reparatur“ der DNA, die die Sicherheitsmarge des Organismus bietet.
Die Wiederherstellung der DNA-Struktur ist besonders wichtig bei der Bildung von Fortpflanzungs-(Geschlechts-)Zellen und in der Embryonalentwicklung: Während der aktiven Synthese neuer Ketten erhöht sich das Risiko des Auftretens und der Wiederholung von Fehlern um ein Vielfaches. Das Erbmolekül muss sehr schnell heilen, und die sich teilenden embryonalen Zellen „wissen“ wie es geht. Während des gesamten Lebens des Organismus werden verschiedene DNA-Schäden beseitigt. Beginnen wir die Geschichte mit den bisher bekannten Schadensarten, um dann die Reparaturmechanismen zu betrachten, denn die Art der Störung hängt davon ab, wie sie behoben wird.
Was kann in der DNA schief gehen?
Aufschlüsselungen sind in allen Bestandteilen der DNA möglich - sowohl in stickstoffhaltigen Basen als auch im Zucker-Phosphat-Rückgrat, sowohl beim Kopieren (Replikation) als auch beim Lesen (Transkription) von Informationen für die anschließende Synthese zellulärer Proteine.
Es kommt häufig zur Apurinisierung des einen oder anderen Nukleotids und zur Desaminierung von Basen. Im ersten Fall werden die glykosidischen Bindungen zwischen Purin (Adenin oder Guanin) und Desoxyribose aufgebrochen, wodurch diese Basen von der DNA-Kette abgespalten werden (der Ort, an dem ein solches Ereignis aufgetreten ist, wird als AP-Stelle bezeichnet). Der zweite Fall - die Desaminierung - führt zur Bildung von Verbindungen, die für die Struktur der DNA ungewöhnlich sind: Anstelle von Cytosin treten Adenin oder Guanin, Uracil, Hypoxanthin bzw. Xanthin auf. Beide Prozesse sind spontan. An einem Tag in einer menschlichen Zelle wird die Apurinisierung 5-10.000 Mal wiederholt, und die Häufigkeit der Desaminierung beträgt ungefähr 100 Ereignisse pro vollständigem Genom.
Die Einwirkung ultravioletter Strahlung führt zur Sättigung der Doppelbindungen von Pyrimidinbasen und zur Bildung von Dimeren aus zwei benachbarten Pyrimidinen im gleichen DNA-Strang. Ionisierende Strahlung kann verschiedene Schäden verursachen: Bruch des Purinrings, Fragmentierung der Base, Oxidation der Apurinstelle und Einzel- und Doppelstrangbrüche (dies ist eigentlich ein Bruch der Chromosomen - die Hauptursache für die tödliche Wirkung der Ionisierung Strahlung). Mehrere chemische Mittel sind in der Lage, DNA-Stränge zu verbinden. Reaktive Sauerstoffspezies (ОН ·, О 2 · -, Н 2 О 2, Lipidperoxide usw.), die ständig in Stoffwechselprozessen gebildet werden, schädigen sowohl Basen als auch Desoxyribose, was zur Bildung neuer kovalenter Bindungen beiträgt. Benachbarte Guanine (GG) sind besonders anfällig für oxidative Wirkungen. Dies sind buchstäblich „Hot Spots“ eines solchen Prozesses, und das Endergebnis ist ein modifiziertes Guanosin-Derivat. Zucker-Phosphat-Bindungen werden in Fällen zerstört, in denen beide DNA-Stränge Purine an gegenüberliegenden Stellen verloren haben oder eine nahezu Desoxyribose-Fragmentierung aufgetreten ist. Dann brechen beide DNA-Stränge auf einmal. Die Quelle von Strukturdefekten kann auch ein natürlicher Prozess sein - die Replikation, wenn ungepaarte Nukleotide in den komplementären Strängen vorkommen.
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Die Zelle ist in der Lage, die aufgeführten Schäden trotz ihrer Unterschiede zu reparieren und die DNA-Struktur wiederherzustellen. Dass dies spezielle Mechanismen erfordert, ist verständlich. Und obwohl sie sich insbesondere voneinander unterscheiden und sehr komplex sind, gehorchen sie doch allgemeinen Prinzipien. Zunächst wird die Art des aufgetretenen Fehlers erkannt. Dies geschieht durch ein oder mehrere Proteine (dann verbinden sie sich an der Fehlerstelle zu einem Komplex). Dann wird der beschädigte Bereich während enzymatischer Reaktionen herausgeschnitten, wonach die DNA-Polymerase das richtige DNA-Stück synthetisiert. Die Reparatur wird durch Zusammenfügen einzelner Kettenfragmente mit DNA-Ligase abgeschlossen. Dies ist das allgemeine Schema, aber jede Art von Reparatur wird von ihren eigenen Proteinen und Enzymen durchgeführt, die ihre Individualität bestimmen. Ist dieses Schema nicht ähnlich wie das übliche Ausbessern von Löchern in Kleidern?
Molekulare Scheren und Pflaster
Der größte Teil der strukturellen Schäden in der DNA wird durch Exzision beseitigt (Experten nennen diese Art der Reparatur exzisional; auf Englisch. Exzisionsreparatur), die von Nukleaseenzymen durchgeführt wird. Die defekte Base wird allein oder zusammen mit der Umgebung entfernt – Kettenabschnitte von 2-10 Nukleotiden. Auf diese Weise werden modifizierte und beschädigte Basen, apurinische Stellen und Stellen mit Einzelstrangbrüchen ausgeschnitten. (Dieser Typ wird als Exzisionsbasenreparatur bezeichnet; Reparatur der Basisexzision, BER.) Bei größeren Fehlfunktionen - dem Auftreten von Pyrimidindimeren oder anderen sperrigen Gebilden in der DNA, die die Struktur der Helix verletzen - schneidet eine Zellschere den beschädigten Teil in einem Stück von 30 Nukleotiden Länge ab. (Dies ist bereits eine exzisionelle Nukleotidreparatur, Nukleotidexzisionsreparatur, NER.)
Die Größe des geschnittenen Stücks und damit des Pflasters hängt von der Schädigung selbst und dem Verhältnis der in der Zelle vorhandenen DNA-Polymerasen ab. Diese Enzyme füllen die Lücken, die nach dem Ausschneiden des abnormalen Bereichs entstanden sind, unter Verwendung eines Fragments des gegenüberliegenden DNA-Strangs als Matrize. DNA-Polymerasen (mehr als 15 davon sind in Eukaryoten bekannt) unterscheiden sich in einer Reihe von Eigenschaften, einschließlich der Anzahl der Nukleotide, die sie in einem einzigen Akt der Bindung an einen DNA-Duplex in die wachsende Kette integrieren. Polymerasen b und l binden nur ein Nukleotid, d.h. ein kleines Pflaster auftragen ( kurzer Patch BER-Pfad, wie Experten sagen). Die beiden anderen DNA-Polymerasen d und e sind in der Lage, ein großes Insert zu erzeugen, benötigen dafür aber einen speziellen Helfer - das PCNA-Protein ( proliferierendes Zellkernantigen). Das erste Enzym ist besonders darauf angewiesen - ohne Assistenten "fällt" es von der DNA ab, nachdem es nur ein Nukleotid eingefügt hat, und wenn PCNA Polymerase d darauf hält, wird die Synthese fortgesetzt, bis das Fragment die erforderliche Länge erreicht hat. Fehlt der Zelle die eine oder andere DNA-Polymerase, kann die Reparatur von einem Weg zum anderen wechseln, d.h. von einem kleinen Fleck zu einem großen ( langer Patch BER-Pfad). Die Zelllinien von Fibroblasten von Mausembryonen stellen die normale Struktur an der Stelle der Apurinisierung hauptsächlich durch einen kleinen Patch (in 80% der Fälle) wieder her, und wenn das DNA-Polymerase b-Gen in den Zellen beschädigt ist, erfolgt die Reparatur ausschließlich durch Auftragen eines großen Pflasters. Die Art und Weise, wie eine Zelle Löcher verstopft, hängt übrigens auch davon ab, wie viel PCNA sie enthält.
Kleine Probleme. Wenn eine Base in der DNA verändert wird, wird sie erkannt, und dann werden N-Glykosylasen ausgeschnitten, wodurch Desoxyribosephosphat in der Kette verbleibt (wie bei der Apurinisierung). Als nächstes wird das Zucker-Phosphat-Rückgrat mit einer AP-Endonuklease (Klasse II) von der 5'-Seite dieses Zwischenprodukts geschnitten, die der AP-Stelle ähnlich ist. Die Zelle kann es auf zwei Arten vollständig entfernen ( kurzer Patch oder langer Patch BER): indem nur der Desoxyribosephosphatrest selbst oder zusammen mit den umgebenden zwei bis zehn Nukleotiden herausgeschnitten wird. Der Patch wird entsprechend der Größe des gebildeten Lochs synthetisiert. Eine Lücke in einem Nukleotid wird durch DNA-Polymerase b aufgebaut. Anders ist es, wenn die in der DNA vorkommende AP-Stelle ebenfalls oxidiert oder reduziert wurde. Diese strukturelle Anomalie wird zusammen mit den umgebenden Nukleotiden von einem anderen Enzym, der FEN1-Nuklease, herausgeschnitten und die entstandene Lücke wird von DNA-Polymerasen d oder e aufgebaut, die nur mit dem Helfer, dem PCNA-Protein, arbeiten. Manchmal werden kurze Lücken (bis zu 5-6 Nukleotide lang) mit DNA-Polymerasen b oder l gefüllt. Sie benötigen keinen Assistenten, da sie selbst am freien 5ў-Ende der Kette neben der Lücke temporär „verankern“ und einige Zeit auf der DNA verweilen können, um die Resynthese der ausgeschnittenen Region durchzuführen.
Seit mehreren Jahren untersuchen wir die Reparatur von Knochenfischen während ihrer Embryonalentwicklung. Während dieser Phase der Ontogenese werden aktiv neue DNA-Stränge synthetisiert, wodurch das Risiko des Auftretens und der Wiederholung von Fehlern um ein Vielfaches steigt. Um dies zu verhindern, muss das Erbmolekül sehr schnell heilen. Wir nahmen zunächst an, dass sich teilende embryonale Zellen über mehrere gleichwertige Methoden zur Reparatur desselben Schadens verfügen sollten. Auf diese Weise würde die DNA-Struktur in allen geschädigten Bereichen gleichzeitig wiederhergestellt und der Prozess auch dann erfolgreich abgeschlossen, wenn andere Reparaturwege aus irgendeinem Grund unterdrückt würden. Doch anstatt unsere Annahme experimentell zu bestätigen, entdeckten wir eine bisher unbekannte Art der DNA-Reparatur. Bei der Arbeit mit Embryonen und Eizellen von Schmerle (Teleostfisch) stießen wir unerwartet auf den eigenständigen Aufbau ziemlich großer Lücken (bis zu 10-13 Nukleotide) durch die DNA-Polymerase d - genau das Enzym, das, wie gerade erwähnt, ohne die PCNA . nicht auskommt Helfer. Aber in der Embryonalperiode der Schmerle brauchte die Polymerase d keinen Assistenten. Es stellte sich heraus, dass dieses Enzym in der Lage ist, gleichzeitig an beide Enden der gebrochenen DNA zu binden und dort fest zu bleiben, bis es „das Loch vollständig flickt“. Dieser Mechanismus der DNA-Reparatur in sich aktiv teilenden embryonalen Zellen war bisher nicht bekannt. Inzwischen ist es sehr wichtig, vor allem wenn man bedenkt, dass die meisten Defekte, die in der DNA entstanden sind, durch einen großen Patch beseitigt werden. Die von uns entdeckte Reparaturmethode ist insofern einzigartig, als sie unter extremen Bedingungen wirkt: ganz ohne oder mit einer unbedeutenden Menge eines Helferproteins und auch dann, wenn der Zelle andere DNA-Polymerasen fehlen, die ohne PCNA auskommen.
Kein Loch, sondern ein Hauch. Ultraviolette Strahlen bewirken eine kovalente Vernetzung benachbarter Pyrimidine (zB Thymin) im DNA-Molekül. Die Erkennung und Exzision der gebildeten Cyclobutandimeren umfasst sieben Proteine - Produkte der XP-Familie (XPA-XPG). Beim Menschen können Mutationen in mindestens einer von ihnen zum Ausbruch einer Erbkrankheit führen - Xeroderma pigmentosa ( Mondscheinkrankheit, XP), die sich in den ersten Lebensjahren eines Kindes manifestiert. In nicht vor Sonnenlicht geschützten Bereichen treten Altersflecken auf und schließlich kann sich Hautkrebs entwickeln.
Warum werden so viele Proteine benötigt und wie funktionieren sie? Jeder von ihnen spielt eine genau definierte Rolle. Das XPA-Protein erkennt das Pyrimidin-Dimer in der DNA und bindet an andere Familienmitglieder. XPB und XPD sind Teil eines komplexen Proteinkomplexes – Transkriptionsfaktor IIH (TFIIH), der die DNA in der auszuschneidenden Region entwindet. Ein anderes Protein, XPC, hält diesen Komplex auf der beschädigten DNA-Region, und die letzten beiden (sie werden Exzisionsnukleasen genannt) – XPF und XPG – funktionieren wie eine Schere. Die erste Nuklease spaltet die 24. Phosphodiesterbindung von der 5'-Seite des Dimers und die zweite spaltet die 5. Bindung von der 3'-Seite. Durch ihre kombinierte Wirkung entsteht eine Lücke von etwa 30 Nukleotiden Länge.
Sie schließen eine so große Lücke mit DNA-Polymerase d oder e, aber sie brauchen einen PCNA-Helfer. Damit das erste Enzym funktioniert, ist außerdem ein weiteres Protein erforderlich - der Replikationsfaktor C (RFC). In Gegenwart von ATP bindet es an das Ende der DNA-Kette, das sich der Lücke von der 5'-Seite nähert, dann wird PCNA angehängt und ein instabiler ternärer Komplex gebildet. Nach der Hydrolyse von ATP ändert sich die Konformation des Replikationsfaktors, um PCNA so zu halten, als ob die Finger geöffnet wären. Dieser Helfer selbst wird durch die vorübergehende Öffnung seiner Kreisform auf den DNA-Duplex geschoben. DNA-Polymerase d ist an den gebildeten stabilen Komplex gebunden, der eine große Lücke aufbaut. Ähnlich funktioniert der Komplex unter Beteiligung der DNA-Polymerase e. Wie Sie sehen, gibt es viele Beteiligte an der Beseitigung von Volumenverletzungen, und der Prozess selbst ist ziemlich kompliziert.
Wenn Gene in Zellen aktiv transkribiert werden (d. h. Boten-RNA wird synthetisiert), schreitet die Nukleotidexzisionsreparatur aufgrund der Einbeziehung von zwei weiteren Proteinen, CSA und CSB, in den Prozess viel schneller voran. Beim Menschen verursachen Mutationen in den Genen dieser Proteine eine Erbkrankheit - das Cockane-Syndrom ( Cockayne-Syndrom, CS), das das Wachstum verlangsamt, die Lichtempfindlichkeit erhöht, Katarakte, Karies und Dermatosen auftreten. Wenn während der Transkription die RNA-Polymerase II, die sie durchführt, auf DNA-Schäden trifft, dann bindet sie an die Proteine CSA und CSB. Dann ist die schnelle Lieferung der Reparaturenzyme an die Abbaustelle gewährleistet, sie schließen die Lücke, woraufhin die Transkription abgeschlossen werden kann.
Fehler beim Weben. Replikationsfehler und Rekombination (Austausch von Standorten) zwischen Allelen können zum Auftreten von ungepaarten Nukleotiden im DNA-Strang führen. Um solche Probleme zu beheben, gibt es eine spezielle Art der Reparatur - die Mismatch-Reparatur (MMR). Der einfachste Weg, sie zu korrigieren, besteht darin, das falsch eingefügte Nukleotid sofort mit den gleichen DNA-Polymerasen d oder e (allerdings mit einer zusätzlichen - Exonuklease-Aktivität) zu entfernen. Eine komplexere Version wird durchgeführt, bei der Enzyme, die den beschädigten Bereich ausschneiden können (Enzyme der Exzisionsreparatur), und eine Gruppe zusätzlicher Proteine zusammenwirken. Sie erkennen ein einzelnes ungepaartes Nukleotid oder Schleifen von bis zu vier Nukleotiden Länge. (Mutationen in den Genen dieser Proteine beim Menschen verursachen eine Prädisposition für Krebs.) Sobald ein Defekt gefunden wird, entfernen Nukleasen ihn zusammen mit 50-500 Nukleotiden auf jeder Seite. Eine riesige Lücke wird durch die gleichen PCNA-abhängigen Polymerasen aufgebaut und sind daher in der Lage, lange DNA-Fragmente zu synthetisieren.
Verordnung. PCNA (wir haben es bereits als Reparaturassistent besprochen) und Protein 53 (p53) sind die Hauptregulatoren in der Zelle, die für ihr Schicksal verantwortlich sind. Das erste Protein, PCNA, ist an der Replikation beteiligt und das zweite, p53, an der Transkription. Doch was machen diese Proteine, wenn beim DNA-Kopiervorgang Schäden auftreten, welche DNA-Polymerase d reparieren soll? Protein 53 stimuliert die Synthese von Protein 21, das das Kopieren der DNA und den Durchgang des Zellzyklus hemmt. Während die Replikation stoppt, gelingt es der Zelle, den Defekt zu beseitigen. Wie kann das sein, da Replikation und Reparatur immer DNA-Synthese sind, an der dasselbe PCNA-Protein beteiligt ist? Die Replikation stoppt aufgrund der Tatsache, dass p21 an PCNA bindet, was bedeutet, dass es für die Reparatur nicht ausreicht. Aber nein: Im Schadensbereich entsteht ein Überschuss an PCNA, der erfolgreich repariert wird.
Einige Wissenschaftler glauben, dass bei einem erhöhten Gehalt an p21 die Resynthese nicht von Polymerase d, sondern von Polymerase b durchgeführt wird, die gegenüber der Wirkung von p21 unempfindlich ist. Basierend auf unseren Ergebnissen gehen wir davon aus, dass sich keine Enzymveränderungen ergeben, sondern lediglich, dass die DNA-Polymerase d von der PCNA-abhängigen Lückenfüllung auf die von diesem Protein unabhängige DNA-Synthese umschaltet.
Wenn die DNA-Struktur wiederhergestellt ist, werden eine Reihe von regulatorischen Proteinen und Enzymen, die an der Reparatur beteiligt sind, durch das 26S-Proteasom hydrolysiert. Solche Proteine umfassen beispielsweise das XPC-Protein. Darüber hinaus kann das Proteasom selbst oder der darin enthaltene 19S-Regulationskomplex die Rolle von molekularen Chaperonen spielen, die den Erwerb der erforderlichen Konformation durch die reparativen Proteine erleichtern. In diesem Fall stimuliert das Proteasom die DNA-Korrektur.
Durch Pausen
Durchbrüche in einem DNA-Molekül sind das Ergebnis von ionisierender Strahlung, Oxidation oder mechanischer Beschädigung. Dieselben Aufbrüche sind in Fällen möglich, in denen während der Replikation auf dem Weg von DNA-Polymerasen ein Bruch in einem Strang auftritt. Doppelstrangbrüche können aber auch Zwischenprodukte normaler biologischer Prozesse sein (zB Rekombination in sich entwickelnden Lymphzellen). Wenn die Zelle die Durchbrüche nicht reparieren kann, kommt es zur Destabilisierung des Genoms, zu Mutationen und zur Entstehung von Krebstumoren und manchmal zum Beginn der Apoptose (programmierter Zelltod). Bei Eukaryoten gibt es zwei Hauptwege zur Beseitigung von Doppelstrangbrüchen: die homologe Rekombination (Rekombinationsreparatur) und das Verbinden nicht-homologe Enden.
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Die Sequenz der DNA-Rekonstruktion, bei der beide Stränge gebrochen sind, nach der Methode der homologen Rekombination ( links) und Verbinden nicht-homologe Enden.Liegt ein homologer DNA-Duplex vor, dessen Sequenz zu mindestens einem abgebrochenen Ende komplementär ist, ist eine Rekombinationsreparatur möglich. Hefe Saccharomyces cerevisiae dies ist die Hauptvariante und hängt vom RAD52-Protein ab, und bei Mutationen im Rad52-Gen werden nicht-homologe Enden verbunden, d.h. die zweite Variante der Wiedergutmachung ist enthalten. Bei Säugetieren hingegen funktioniert hauptsächlich die zweite Methode, bei Drosophila sind beide Wege gleichwertig. Unabhängig von der Art der Reparatur werden Fragmente unterschiedlicher Länge einfach herausgeschnitten, eine nachträgliche Restaurierung ist nicht vorgesehen. Natürlich wird in diesem Fall die Primärstruktur der DNA zerstört und Informationen, die in abgelegenen Gebieten kodiert sind, gehen verloren. Da aber Doppelstrangbrüche relativ selten sind, scheint es für eine Zelle rentabler, solche Opfer zu bringen, als die DNA zerrissen zu lassen.
Die erste Methode der DNA-Reparatur ist typisch für Hefe ( Saccharomyces cerevisiae), die zweite gilt für Säugetiere, einschließlich des Menschen.
Erläuterungen im Text.
Homologer Austausch. Das Protein RAD52, von dem die Rekombinationsreparatur in Hefe abhängt, bindet, wie gerade erwähnt, an die hervorstehenden Enden der gebrochenen DNA-Stränge und schützt sie so vor der Wirkung von Exonukleasen. Dann stimuliert RAD52 die Anheftung des RAD51-Proteins an die Stellen, an denen es sich befand. Danach werden ein Ende oder beide in den homologen DNA-Duplex eingefügt und es erfolgt eine Rekombination. Die aus der „Lücke“ herausragenden DNA-Anteile werden herausgeschnitten und die entstandene Lücke wird sofort von gegenüberliegenden Seiten aufgebaut, d.h. die Synthese der Fragmente geht aufeinander zu. In Hefezellen S.cerevisiae sie wird von den Polymerasen d und e durchgeführt, die PCNA und einen Replikationsfaktor (RFC) benötigen, um am baumelnden Ende der DNA zu bleiben und die Synthese durchzuführen. Die DNA-Polymerase a, die einzige von vielen Polymerasen, die die DNA-Synthese in der Replikationsgabel initiieren kann, wo sich die Fäden aufzulösen beginnen, ist zwar auch daran beteiligt, die Lücke zu schließen. Unter Berücksichtigung der Beteiligung dieses Enzyms an der DNA-Reparatur durch Brüche schlugen A. Holmes und J. Haber ein Modell vor, nach dem die Insertion eines der gebrochenen Enden in einen homologen DNA-Duplex eine ungewöhnliche Replikationsgabel erzeugt, bei der die Ketten synthetisiert. Die Replikation endet, wenn das andere Ende die Lücke erreicht. Der „überhängende“ Endabschnitt des zweiten Strangs, der sich als überflüssig herausstellte, wird durch Nuklease entfernt.
Die homologe Rekombination ist mit einem anderen Verfahren zum Ausbessern der Fehlerstellen verbunden. Die abgebrochenen DNA-Enden werden vom Bruch bis zur Freilegung der komplementären Sequenzen Stück für Stück durch eine spezifische Exonuklease in beide Richtungen zerschnitten. Es folgt das Annealing (Pairing) komplementärer Regionen und das Abschneiden der „hängenden“ nicht-homologen DNA-Schwänze. Dieser Reparaturweg hängt auch vom RAD52-Protein ab.
Verbindung von nicht homologen Enden. Die Reparatur der auf diese Weise in beiden Strängen gebrochenen DNA wird von einer ganzen Reihe von Proteinen übernommen. Dies ist das Ku-Protein und der Komplex, der von DNA-Ligase IV und dem XRCC4-Genprodukt gebildet wird. Sie sind alle in Eukaryoten konserviert, einschließlich Hefen und Säugetieren. Trotz der Tatsache, dass bei der Reparatur die abgerissenen Enden direkt verbunden werden, ohne eine Matrix für die Synthese zu verwenden, muss der Prozess so genau und präzise wie möglich sein. Diese Anforderung wird durch das Ku-Protein erfüllt, das ein Heterodimer der Ku70- und Ku80-Untereinheiten ist (Molekulargewicht 70 bzw. 80 kDa). Kürzlich wurde die Kristallstruktur des humanen Heterodimers sowie die Struktur seines Komplexes mit einem DNA-Fragment von 55 Nukleotiden untersucht. Es stellte sich heraus, dass das Ku-Heterodimer den DNA-Duplex ringförmig umschlingt, die DNA-Basen aber nicht kontaktiert, sondern mehrere Bindungen mit dem Zucker-Phosphat-Rückgrat eingeht und den Windungen der DNA-Helix räumlich so angepasst ist, dass sie angeordnet sind im Proteinring auf streng definierte Weise. Diese Konfiguration des Ku-DNA-Komplexes ist offensichtlich notwendig, um die Struktur der hervorstehenden baumelnden Enden zu erhalten, die für die nächsten Reparaturschritte geeignet ist.
Und davon gibt es mehrere. Zuerst werden die baumelnden Enden der DNA über das Heterodimer „aufgezogen“, dann binden sie sich aneinander und bilden eine Brücke. Daran schließen sich die übrigen Teilnehmer an und erfüllen ihre Funktionen: DNA-Polymerase füllt die Lücken, die durch das Verbinden nicht homologe DNA-Enden entstanden sind; Nuklease schneidet abstehende Enden ab, wenn sie zu lang sind; Ligase IV verknüpft die gewonnenen Fragmente zu einem einzigen Ganzen. In einigen Eukaryoten wurde DNA-Polymerase m gefunden, die anscheinend DNA-Lücken füllt.
Wenn die Ketten genäht sind
Einige chemische Wirkstoffe wie Krebsmedikamente (Cisplatin, Mitomycin, Psoralen) verursachen eine DNA-Vernetzung. Eukaryoten sind in der Lage, solche Fehlfunktionen zu beseitigen, aber die Reparaturmechanismen sind nicht klar genug. Es ist bekannt, dass angehende Hefe S.cerevisiae sie hängt von Enzymsystemen ab, die beispielsweise die Entfernung von Thymindimeren (wie bereits erwähnt) gewährleisten, und von der Rekombination. Das gleiche Sieben-Protein-Enzymsystem (XPA-XPG) funktioniert, wie bereits erwähnt, bei der Reparatur menschlicher DNA mit vernetzten Strängen. Nur die Dinge sind noch komplizierter. Zur Erinnerung: Eines der Proteine, XPF, schneidet den DNA-Strang von der 5'-Seite vor Schäden im Abstand von 20 (± 5) Nukleotiden, das andere, XPG, von der 3'-Seite 6 (± 3) Nukleotide von der Dimer. In menschlicher DNA schneiden diese Endonukleasen jedoch 22-28 Nukleotide in einem DNA-Strang und nur auf einer Seite der Naht heraus, ohne den Defekt selbst zu beeinträchtigen. Warum schneidet die menschliche Nuklease die Kette nicht auf die übliche Weise auf beiden Seiten des Schadens? Daher glauben die Forscher, dass vor dem Schneiden die Doppelhelix abgewickelt werden muss (dazu dient das Enzym Helikase). Es kann den Duplex jedoch nicht in der Nähe des Stitchings aufdrehen, sondern in einem Abstand davon - in einem Abstand von 20 (± 5) Nukleotiden von der 5ў-Seite. Der Vliesbereich nimmt das Aussehen einer Blase an. Zu diesem Zeitpunkt bricht eine Endonuklease, XPG, die Kette an ihrer richtigen Stelle (d. h. näher am Defekt), während die andere, XPF, ungefähr die 27. Phosphodiesterbindung von der 5'-Seite der Verknüpfung bricht. Dies ist jedoch nur der erste Schritt bei der DNA-Reparatur mit Quervernetzung.
Was kommt als nächstes? Nach einem der entwickelten hypothetischen Modelle folgt die Rekombination eines homologen DNA-Duplex. Es ist eine große Lücke von 22-28 Nukleotiden, die diesen Prozess einleitet. Aber im Stadium der Kettenübertragung wird es blockiert, woraufhin eine spezifische Endonuklease denselben Faden auf der anderen Seite des Glieds schneidet. Das neu gebildete Zwischenprodukt wird von den Komponenten der „molekularen Schere“ (Exzisions-Reparatur-System) erkannt und der zweite Schnitt, nun doppelt, im zweiten Gewindegang durchgeführt. Dadurch werden die vernetzten Oligomere freigesetzt und die Rekombination ist abgeschlossen. Somit wird ein Strang durch Rekombination repariert. Eine Lücke im zweiten Strang wird durch DNA-Polymerase aufgebaut, wobei der erste als Matrize verwendet wird.
Es ist interessant festzustellen, dass kürzlich ein Protein mit Helikase- und DNA-Polymerase-Domänen in höheren Eukaryoten entdeckt wurde. Mutationen in seinem Gen erhöhen die Empfindlichkeit des Körpers gegenüber Wirkstoffen, die eine Quervernetzung zwischen DNA-Strängen verursachen, erheblich. Und da in bestimmten Stadien der Reparatur von vernetzter DNA aufgrund der Rekombination sowohl Helikase- als auch Polymerase-Aktivitäten notwendig sind, wurde geschlossen, dass dieses Protein an einem solchen Reparaturprozess beteiligt ist. Anschließend wurde das einzigartige Protein DNA-Polymerase q genannt.
| Ein hypothetisches Schema zur Eliminierung der DNA-Vernetzung. Erläuterungen im Text. |
Wenn der Schaden nicht beseitigt ist
DNA-Schäden bei Eukaryoten sind also unterschiedlich. Und obwohl es wirksame Mechanismen gibt, um solche Defekte zu beseitigen, ist die Zelle manchmal aus dem einen oder anderen Grund nicht in der Lage, jeden einzelnen von ihnen zu beseitigen. In diesem Fall stoppt die DNA-Replikation an den beschädigten Regionen der Matrix. Bis vor kurzem war nicht klar, wie DNA in geschädigten Bereichen kopiert wird, die mit bekannten Methoden nicht beseitigt werden können. Dies wurde vor kurzem deutlich.
In den letzten Jahren wurde eine neue Gruppe von DNA-Polymerasen - z, h, k, i, m, REV1 - entdeckt, die genau darauf ausgelegt ist, solche Schäden zu beseitigen. Die Polymerasen z, h und m führen eine DNA-Resynthese durch, wenn Cyclobutandimere zwischen benachbarten Thyminen darin nicht verfügbar sind; die letzten beiden Enzyme sowie die Polymerasen k und REV1, während sie oxidierte Guanin- und Apurin-Stellen erhalten, und REV1-Polymerase baut auch erfolgreich Stellen mit O (6) -Methylguanin auf. Interessanterweise arbeitet die z-Polymerase „im Tandem“ mit der Polymerase h oder REV1, wobei die beschädigte DNA-Region, die von ihnen passiert wird, um mehrere Nukleotide verlängert wird.
Während der DNA-Replikation inserieren diese Polymerasen manchmal die richtigen Nukleotide gegen beschädigte Regionen der Matrize, während die DNA-Struktur nicht gestört wird. In einigen Fällen sind die falschen Nukleotide enthalten, und dann treten Mutationen auf. Derzeit wird einer neuen Gruppe von DNA-Polymerasen besondere Aufmerksamkeit gewidmet, da Zellen einen enzymatischen Apparat benötigen, der in der Lage ist, DNA in Situationen zu synthetisieren, in denen eine Exzisionsreparatur ineffektiv oder unmöglich ist und das Risiko einer Mutationsakkumulation gerechtfertigt ist.
* * * Der ursprüngliche Mechanismus zur Reparatur von DNA-Schäden scheint von der Zelle ausgegangen zu sein. Mit der Entwicklung der Organismen wurde es komplexer, neue Optionen tauchten auf. Wie wichtig dieser Mechanismus ist, lässt sich daran ablesen, dass mehrere Dutzend Gene an der Beseitigung von DNA-Störungen beteiligt sind und die Zelle den Großteil ihrer Ressourcen für die Produktion von Reparaturenzymen aufwendet. Die Zuverlässigkeit der Erhaltung von DNA-Nukleotidsequenzen in höheren Eukaryoten ist sehr hoch: Beispielsweise werden im Säugetiergenom, das etwa 3 Milliarden Basenpaare umfasst, in den Zellen des embryonalen Weges nur 10-20 Basen pro Jahr ersetzt und Tausende von Nukleotide sind beschädigt. Erfordert besondere Zuverlässigkeit Embryonalperiode: Wenn sich Zellen aktiv teilen, ist es notwendig, zahlreiche Störungen so schnell wie möglich zu reparieren und die Erbinformation intakt zu halten. Die Systeme, dank denen die natürliche Struktur der DNA wiederhergestellt wird, schützen nicht nur das Genom vor Schäden aller Art, sondern dienen auch den genetischen Prozessen in der Zelle. Und wenn aus irgendeinem Grund der Reparaturprozess selbst gestört wird, kann dies zu ernsthaften Problemen für die Zellen und den gesamten Organismus führen. So besteht eine erhöhte Veranlagung für bestimmte Erkrankungen bis hin zu onkologischen und schweren Erbkrankheiten. Die Kenntnis der Mechanismen, die zu verschiedenen Krankheiten führen, ist für die praktische Medizin äußerst notwendig, um die Suche nach Behandlungsmöglichkeiten zu erleichtern. Und natürlich schließt Wissen eine weitere Lücke im Verständnis der Welt, auch wenn sie molekular ist.
Diese Arbeit wurde von der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung unterstützt. Projekte 00-04-49183, 03-04-49127.
Literatur
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DNA ist ein lineares Polymer, das 70-80 bis 10 9 Mononukleotide enthält, die durch kovalente Phosphodiesterbindungen zwischen der Hydroxylgruppe der Pentose eines Nukleotids und der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids verbunden sind.
Die Daten der Röntgenstrukturanalyse zeigten, dass das DNA-Molekül der meisten lebenden Organismen, mit Ausnahme einiger Phagen, aus zwei Polynukleotidketten besteht, die antiparallel gerichtet und so ausgerichtet sind, dass ihre Zucker-Phosphat-Rückgrate außen liegen, und stickstoffhaltig Basen sind drin. Die Basen sind paarweise gegenüberliegend angeordnet und durch Wasserstoffbrücken verbunden. Paarungen treten nur zwischen komplementären (miteinander passenden) Basen auf: einem Purin und einem Perimedin. Das AT-Paar ist durch zwei und das G-C-Paar durch drei Wasserstoffbrücken verbunden. Das DNA-Molekül hat die Form einer Doppelhelix, in der Polynukleotidketten um eine imaginäre Mittelachse verdreht sind.
Die DNA-Helix ist durch eine Reihe von Parametern gekennzeichnet:
Spiralbreite etwa 2 nm;
die Ganghöhe oder vollständige Windung der Helix beträgt 3,4 nm und enthält 10 Paare komplementärer Nukleotide.
DNA hat einzigartige Eigenschaften: die Fähigkeit zur Selbstverdoppelung (Replikation) und die Fähigkeit zur Selbstreparatur (Reparatur).
20 Proteine: Erkennen veränderter DNA-Regionen und Entfernen dieser aus der Kette, Wiederherstellen der korrekten Nukleotidsequenz und Zusammenfügen des wiederhergestellten Fragments mit dem Rest des DNA-Moleküls 5% der gesamten zellulären RNA.
Reproduzieren wird unter der Kontrolle einer Reihe von Enzymen durchgeführt und verläuft in mehreren Stufen. Es beginnt an bestimmten Stellen im DNA-Molekül. Spezielle Enzyme brechen Wasserstoffbrücken zwischen den komplementären stickstoffhaltigen, und die Spirale wickelt sich ab. Die Nukleotidketten des Stammmoleküls werden in einem unverdrillten Zustand gehalten und dienen als Matrize für die Synthese neuer Ketten.
Mit Hilfe des Enzyms DNA-Polymerase werden aus den im Medium vorhandenen Triphosphaten der Desoxyribonukleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) Tochterketten zur Ergänzung der Mutterketten aufgebaut. Die Replikation erfolgt gleichzeitig auf beiden Mutterketten, jedoch mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten und einigen Unterschieden. Auf einer der Ketten (voreilend) ist die Montage der Tochterkette kontinuierlich, auf der anderen (nacheilend) - einer fragmentarischen. Anschließend werden die synthetisierten Fragmente unter Verwendung des DNA-Ligase-Enzyms gemischt. Dadurch entstehen aus einem DNA-Molekül zwei DNA-Moleküle, die jeweils eine Mutter- und eine Tochterkette besitzen. Die synthetisierten Moleküle sind exakte Kopien voneinander und des ursprünglichen DNA-Moleküls. Diese Methode der DNA-Replikation wird als semikonservativ bezeichnet und gewährleistet eine genaue Reproduktion der Informationen, die im Muttermolekül aufgezeichnet wurden, in den Tochtermolekülen.
Wiedergutmachung ist die Fähigkeit eines DNA-Moleküls, die in seinen Ketten auftretenden Veränderungen zu "korrigieren". Die Wiederherstellung des ursprünglichen DNA-Moleküls umfasst mindestens
Die aufgeführten Merkmale der chemischen Struktur und Eigenschaften der DNA bestimmen die Funktionen, die sie ausführt. DNA zeichnet genetische Informationen auf, speichert, reproduziert sie und beteiligt sich an den Prozessen ihrer Implementierung zwischen neuen Generationen von Zellen und Organismen.
Ribosomale RNA (rRNA) wird hauptsächlich im Nukleolus, im Bereich der rRNA-Gene synthetisiert und wird durch verschiedene Molekulargewicht Moleküle, die Teil der großen oder kleinen Subpartikel von Ribosomen sind. RRNA macht 85% der gesamten Zell-RNA aus.
Transport-RNA (tRNA) macht etwa 10 % der zellulären RNA aus. Es gibt über 40 Arten von tRNA. Bei der Umsetzung der genetischen Information hängt jede tRNA eine bestimmte Aminosäure an und transportiert sie an die Stelle des Polypeptid-Assemblys. In Eukaryoten sind tRNAs 70-90 Nukleotide lang und haben eine Kleeblattstruktur.
Ribonukleinsäuren - RNA - werden durch Moleküle unterschiedlicher Größe, Struktur und Funktion repräsentiert. Alle RNA-Moleküle sind Kopien bestimmter Bereiche des DNA-Moleküls und neben den bereits erwähnten Unterschieden fällt es kürzer aus und besteht aus einem Strang. Zwischen einzelnen zueinander komplementären Regionen des gleichen RNA-Strangs sind Basenpaarungen (A-U, G-C) und die Bildung von helikalen Abschnitten möglich. Dadurch erhalten die Moleküle eine bestimmte Konformation.
Matrix- oder Informations-RNA(mRNA, mRNA) im Zellkern unter der Kontrolle des RNA-Polymerase-Enzyms synthetisiert, das komplementär zu informativen DNA-Sequenzen ist, überträgt diese Informationen auf Ribosomen, wo sie zu einer Matrix für die Synthese eines Proteinmoleküls werden. Je nach Menge der kopierten Informationen kann das mRNA-Molekül verschiedene Längen und macht etwa 5 % der gesamten zellulären RNA aus.
Unter Einwirkung von Alkylierungsmitteln, beispielsweise N-Methyl-rTG-Nitrosoharnstoffen oder Ch^rN-Dimethylnitrosoguanidin, entstehen in der DNA O 6 -Methyl- oder O 6 -Alkyl-substituierte Guaninreste. Solche modifizierten Guaninreste können unter Beteiligung von Enzymen, die in Bakterien- und Säugerzellen vorhanden sind, dealkyliert werden. О 6-Methylguanin-DNA-Alkyltransferase katalysiert die Übertragung von Alkylgruppen auf Sulfhydrylgruppen von Cysteinresten des Enzyms, während das Akzeptorprotein inaktiviert wird. Der Gehalt an Alkyltransferase in E. coli-Zellen steigt in Gegenwart von O 6 -Alkylguanin an, aber in Säugerzellen wird keine ähnliche Induzierbarkeit beobachtet.
Wenn DNA mit ultraviolettem Licht bestrahlt wird, werden darin Cyclobutandimere zwischen benachbarten Pyrimidinbasen gebildet. Solche Verbindungen blockieren die DNA-Replikation und müssen entfernt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Eine Möglichkeit zur Entfernung von Pyrimidin-Dimeren besteht in ihrer enzymatischen Umwandlung in Monomere durch Beleuchten der Lösung mit sichtbarem Licht im Wellenlängenbereich von 300-600 nm. Solche photoreaktivierenden Enzyme werden in Bakterien und niederen eukaryontischen Organismen gefunden, jedoch nicht in Säugerzellen. Das Enzym bildet mit dem Pyrimidin-Dimer einen stabilen Komplex und zerstört mit Hilfe der Energie des von ihm absorbierten Lichts das Dimer, ohne DNA-Stränge zu brechen.
B. Reparatur durch Austausch modifizierter Rückstände
Der Austausch eines modifizierten Nukleotids erfolgt normalerweise in vier Schritten. Zuerst erkennt das Enzym dieses Nukleotid und schneidet die Polynukleotidkette in seiner Nähe oder bricht die glykosidische Bindung zwischen der modifizierten Base und Desoxyribose. Zweitens entfernt die Exonuklease das modifizierte Nukleotid und/oder benachbarte Nukleotide und hinterlässt eine kleine Lücke. Drittens wird die deletierte Region erneut vom 3-OH-Terminus synthetisiert, wobei der Gegenstrang als Matrize verwendet wird. Viertens werden die Enden der als Ergebnis der Reparatur gebildeten Lücke verbunden, um die kovalente Integrität der reparierten Kette wiederherzustellen.
Stellen, an denen eine Depurinisierung oder Depyrimidinisierung stattgefunden hat, werden durch Enzyme, die als AP-Endonukleasen bezeichnet werden, gespalten. In Pro- und Eukarienzellen gibt es viele verschiedene AP-Endonukleasen, oft mehrere verschiedene Typen... Einige AP-Endonukleasen schneiden die Kette von der 3"-Seite der AP-Stelle, während andere die Diesterbindung von der 3"-Seite spalten; in jedem Fall werden 3"-Hydroxyl- und 5"-Phosphoryl-Enden gebildet. Die Spaltung der Phosphodiesterbindung auf der einen oder anderen Seite der Schadensstelle ermöglicht es der Exonuklease, benachbarte Reste auf beiden Seiten der Spaltungsstelle zu entfernen und dann die deletierte Sequenz erneut zu synthetisieren.
Bei der Reparatur von N-alkylierten Purinen und anderen modifizierten Basen spielen spezifische N-Glykosylasen eine Schlüsselrolle – Enzyme, die die glykosidische Bindung zwischen modifizierten Basen und Desoxyribose spalten. N-Glykosylasen werden auch zur Korrektur von Störungen verwendet, die in der spontanen Desaminierung von Cytosin oder Adenin und deren Umwandlung in Uracil bzw. Hypoxanthin bestehen. Die Enzyme Uracil-Glykosylase und Hypoxanthin-Glykosylase spalten Uracil bzw. Hypoxanthin von der DNA ab und hinterlassen Lücken an der Spaltstelle. Und wieder wird durch den Spaltungs-Resynthese-Mechanismus die ursprüngliche Sequenz der beschädigten Kette wiederhergestellt.
Uracil-Glykosylase spielt eine sehr wichtige antimutagene Rolle bei der Korrektur von Fehlern, die auftreten, wenn dUTP anstelle von dTTP während der Replikation verwendet wird. Da die Paarung von dUMP mit der Matrix fast genauso gut wie dTMP erfolgt, erkennt Pol III dies nicht, und wenn dUMP nicht spezifisch gespalten wird, kann dGMP während der nächsten Replikationsrunde in den neuen Strang eingebaut werden. Somit schützt g-Glycosylase Zellen vor möglichen mutagenen Folgen des dUMP-Einschlusses in den DNA-Strang.
Die Reparatur von Thymindimeren kann auch im Dunkeln auf eine der folgenden beiden Arten erfolgen. In E. coli-Zellen werden drei Polypeptide synthetisiert, die von den Genen uvrA, uvrB und uvrC kodiert werden, die einen Enzymkomplex uvrLVC-Endonuklease bilden. Dieses Enzym schneidet den DNA-Strang, der das Pyrimidin-Dimer enthält, in einem Abstand von acht Phosphodiester-Bindungen von der 5"-Seite und vier oder fünf Bindungen von der 3"-Seite des Pyrimidin-Dimers. Die Entfernung der beschädigten Region scheint durch Helikase katalysiert zu werden, die von einem anderen Gen, uvrD, kodiert wird. Dadurch werden das Thymin-Dimer und etwa 12 weitere umgebende Nukleotide entfernt. Die entstandene Lücke wird mit Pol I gefüllt und DNA-Ligase vervollständigt die Reparatur, indem sie zwei benachbarte Basen der Kette verbindet. Einige Organismen verwenden einen anderen Mechanismus, um Schäden zu reparieren, die durch die Bildung von Pyrimidin-Dimeren entstehen. Die Reparatur erfolgt unter Beteiligung von Pyrimidin-Dimer-g-Glycosylase, die eine Apyrimidin-Stelle erzeugt. Die glykosidische Bindung zwischen einem der Thymine und Desoxyribose wird unterbrochen, so dass das Thymindimer am 5"-Ende der gebrochenen Kette verbleibt und die 3"-OH-Gruppe an der Desoxyribose verbleibt. Das resultierende 3"-AP-Ende wird durch die 3"-5"-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase gespalten, und dann wird das Nukleotid durch Nick-Translation und Ligation zusammen mit dem angrenzenden Thymin-Dimer entfernt, die Lücke wird gefüllt und die Enden der Kette sind vernäht.
V. Die Bedeutung der DNA-Reparatur
Zellen haben im Laufe der Evolution einen komplexen Mechanismus zur Beseitigung von Schäden entwickelt, die in der DNA unter dem Einfluss verschiedenster chemischer und physikalischer Faktoren sowie durch Replikations- oder Rekombinationsfehler auftreten. Und das ist durchaus verständlich: Die meisten Schäden blockieren die Übertragung der genetischen Information an die nächste Generation, und der Rest verbleibt, wenn er nicht beseitigt wird, im Genom der Nachkommen und führt zu dramatischen Veränderungen in Proteinmolekülen, einschließlich Enzymen, die für die Aufrechterhaltung notwendig sind Zellleben. Wenn bestimmte Teile des Reparatursystems beschädigt sind, werden Zellen besonders anfällig für bestimmte chemische und physikalische Einwirkungen. Beispielsweise sind E. coli-Zellen, bei denen das System zum Einbringen von DNA-Brüchen bei der Freisetzung von Thymin-Dimeren gestört ist, sehr empfindlich gegenüber UV-Licht. Zellen, die nicht in der Lage sind, die eine oder andere N-Glykosylase-Reaktion durchzuführen, sind gegenüber der mutagenen oder tödlichen Wirkung von Alkylierungsmitteln oder ionisierender Strahlung viel anfälliger als normale Zellen. In Pol I defekten E. coli-Zellen ist die Überlebensrate bei Bestrahlung mit niedrigen UV-Dosen signifikant reduziert.
Der Vertreter der niederen Eukaryoten, Saccharomyces cerevisiae, besitzt mindestens fünf Gene, die für Proteine kodieren, die an der Entstehung von Brüchen in UV-bestrahlter DNA beteiligt sind. Eine Störung in nur einem dieser fünf RAD-Gene führt dazu, dass die Zellen die Fähigkeit verlieren, DNA-Brüche zu machen und folglich Pyrimidin-Dimere zu entfernen. In Hefe gibt es auch Mutanten mit einer eingeschränkten Fähigkeit, Quervernetzungen zwischen Strängen zu entfernen, obwohl die Beseitigung von UV-induzierten Schäden normal ist. Dies legt nahe, dass in Hefe, wie auch im Menschen, spezifische, hochkomplexe Reparaturmechanismen existieren, um Querverbindungen zu entfernen und möglicherweise viele andere chemische Modifikationen in der DNA zu korrigieren.
Menschen mit Xeroderma pigmentosa reagieren sehr empfindlich auf ultraviolettes Licht und entwickeln bereits bei geringer Exposition verschiedene Formen von Hautkrebs. Sonnenlicht... Die Zellen solcher Menschen tragen eine der Hefe-RAD-Mutation ähnliche Mutation, die sich darin äußert, dass sie eine eingeschränkte Fähigkeit haben, Pyrimidin-Dimere aus UV-bestrahlter DNA abzuspalten. Die Krankheit kann durch eine Mutation in einem von mindestens neun Genen verursacht werden, was auf einen ziemlich komplexen Mechanismus für die Reparatur von DNA mit Thymindimeren beim Menschen hinweist. Die Erkrankung ist in der Regel mit einer Unfähigkeit verbunden, Thymindimere zu spalten. Wird den bestrahlten Zellen in Kultur ein Enzym mit Thymin-Dimerglycosylase- und AP-Endonuklease-Aktivität zugesetzt, können UV-Schäden beseitigt werden.
allgemeine Daten
Wie in Kapitel 6 besprochen, erfüllen Zellmembranen unter normalen Bedingungen viele Funktionen. Plasma- und intrazelluläre Membranen funktionieren entweder unabhängig - hauptsächlich aufgrund von integralen Proteinen, die sich auf beiden Seiten der Membran befinden, oder nehmen an den mit ihnen verbundenen Zellfunktionen (aufgrund der Kontrolle von der Seite der Rezeptor- und Transportproteine) sowie der Funktionen von die strukturellen Bestandteile der Zelle, die aus anderen Proteinen, Lipiden, Zuckern und Spurenelementen gebildet werden.
Im Allgemeinen geht die Zellschädigung mit Verletzungen der darin ablaufenden genetischen, biochemischen und physikalisch-chemischen Prozesse einher und ist mit Transformationen von Makro- und Mikromolekülen verbunden, darunter: Polynukleotide und Nukleotide, Polypeptide und Peptide, Polysaccharide und Monosaccharide, Lipide und deren Bestandteile ( Phospholipide, Sphingolipide, Fettsäuren, Cholesterin) sowie die Bewegung von Metallionen und anderen chemischen Verbindungen, freien Radikalen, Elektronen, atomaren und attomolaren Strukturen.
Deshalb ist die Bedeutung ihrer schützenden und aufbauenden (Reparatur-)Enzymsysteme für die Zelle bei unterschiedlichen Schädigungen so groß. Betrachten Sie diese Systeme unter Berücksichtigung der Angaben in den vorherigen Kapiteln des Handbuchs über Aufbauorganisation, Ursachen und Mechanismen von Zellschäden sowie Daten zu den wichtigsten Formen des Zelltods.
SCHUTZ UND WIEDERHERSTELLUNG
ENZYMISCHE SYSTEME DES KÖRPERS
Zu den wichtigsten Schutz- und Regenerationssystemen des Körpers gehören bekanntlich das Nerven-, Hormon- und Immunsystem (siehe Kapitel 13-15). Dann (von Bedeutung) sind die Entgiftungssysteme der inneren Organe (Leber, Milz, Niere),
Gewebe (Haut und Schleimhäute) und schließlich zelluläre Abwehr- und Reparatursysteme, einschließlich: Systeme von Cytochrom P 450, Glutathion-abhängige Enzyme, Superoxiddismutase (SOD), Katalase, Plasmalogene, Peroxidasen und Phospholipasen (insbesondere Phospholipide) und andere Systeme, die mit der Wiederherstellung der strukturbildenden Komponenten der Zelle verbunden sind. Besondere Beachtung verdienen zahlreiche DNA-Reparatursysteme und noch wenig erforschte enzymatische Abwehrsysteme biologischer Körperflüssigkeiten (Blut, Lymphe, Hirnflüssigkeit, Magen- und Darmsaft). Alle diese Schutz- und Wiederherstellungssysteme des Körpers basieren auf der Wirkung von Genen, die in einem einzigen Gennetzwerk vereint sind (siehe Kapitel 2).
Betrachten wir zunächst die bekanntesten Zellabwehrsysteme.
Xenobiotische Entgiftungssysteme
Systeme zur Inaktivierung (Entgiftung) von körperfremden Substanzen oder Xenobiotika werden durch die Gene der äußeren Umgebung gesteuert, die die Synthese zahlreicher Protein-Enzyme kodieren, die den Körper metabolisieren (abbauen und entgiften) und Xenobiotika entfernen.
Mutationen in Entgiftungsgenen führen oft zu einer erblichen Veranlagung für schwere Erkrankungen, die verschiedene Systeme Organismus und einzelne Organe. Beispielsweise ist die Beziehung zwischen den klinischen Manifestationen der durch eine Major-Mutation (CFTR) verursachten Mukoviszidose und dem Zustand der Gene des Entgiftungssystems gut untersucht. Die Hauptmanifestationen dieser Krankheit sind eine schwere chronisch-obstruktive Lungenentzündung, die in der Regel zum vorzeitigen Tod kranker Kinder führt, die das 20. Lebensjahr nicht erreichen. Mutationen der Entgiftungsgene selbst wiederum prädisponieren oft für die Entwicklung von Lungenerkrankungen: Asthma bronchiale, chronisch obstruktive Bronchitis, Krebs, Emphysem und andere Lungenerkrankungen.
Es wurde auch vorgeschlagen, dass allelische Varianten von Entgiftungsgenen die klinischen Manifestationen bei Mukoviszidose beeinflussen können. Diese Annahme wurde in der Arbeit von M.A. Bakaiet al. (1999). Es stellte sich heraus, dass Patienten mit Mischform und schwerem Verlauf der Mukoviszidose entweder homozygot für das "Null"-Allel des Glutathiontransferase M1-Gens (GSTM1 0/0) waren -
Enzym der zweiten Entgiftungsphase von Xenobiotika oder hatte ein langsam exprimiertes S-Allel des Gens der ersten Entgiftungsphase - mikrosomale Epoxyhydrolase (mEPXH).
Diese Arbeit stellte auch ein signifikantes Überwiegen des homozygoten Zustands für das S (oder S/S)-Allel im mEPXH-Gen bei Patienten mit chronischen Atemwegserkrankungen fest.
Angesichts der klaren Korrelation der Lungenpathologie mit dem "langsamen" Allel des mEPXH-Gens und dem "null"-Allel des GSTM1-Gens wurde gefolgert, dass bei Patienten mit Mukoviszidose mit der entsprechenden Verteilung von Allelen (mEPXH S / S und GSTM1), die Lungenpathologie entwickelt sich am häufigsten und verläuft besonders ungünstig. Aus diesem Grund hielten es die Autoren für sinnvoll, nicht nur die Art der Mutation im Mukoviszidose-Gen aufzuklären, sondern auch die Fälle der Verschleppung ungünstiger Allele der mEPXH S/S- und GSTM1-Gene bei Patienten zu ermitteln. Mit anderen Worten, diese Arbeit zeigte einen deutlichen Einfluss einiger Allele der DQA1-Gene des HLA-Locus auf die Schwere von Mukoviszidose und chronischen Atemwegserkrankungen.
Entgiftung mit Cytochrom P 450
In den Membranen des ER von Leberzellen sowie anderen Organen und Geweben befinden sich Monoxidase-Enzymsysteme, die in der ersten Phase des Entgiftung. Diese Systeme werden aus den Cytochrom P 450 Hyperfamilien oder Monooxygenasen gebildet, die eine Vielzahl von exogenen und endogenen Substraten metabolisieren.
Bis Januar 2006 wurden 1174 Proteine und die entsprechende Anzahl ihrer kodierenden Gene für Cytochrome P 450 im Genom von Mensch und Tier identifiziert (Lisitsa A.V., 2007). Die Zahl der bekannten chemischen Verbindungen, die mit Enzymen des Cytochrom-P-450-Systems interagieren, betrug 1708, darunter 1223 Substrate, 115 Induktoren und 484 Inhibitoren.
Im menschlichen Körper wurden etwa 50 Formen von Cytochrom P 450 isoliert (Helson, 1998), die an der Monooxygenase-Katalysereaktion beteiligt sind und aufgrund ihrer Fähigkeit, selektiv an das Substrat zu binden, eine führende Rolle dabei spielen. Die Funktion der Cytochrome P 450 wird durch ihre Wechselwirkung mit Partnerproteinen bestimmt. Cytochrom-P 450-Enzyme schließen die Elektronentransferkette und verwenden die resultierenden Redox-Äquivalente, um das Substrat zu oxidieren. Wie-
Cytochrom P 450 Partnerproteine können entweder mehrere Proteine sein, beispielsweise NADPH-Cytochrom P 450 Reduktase und Cytochrom b5 sowie Adrenodoxinreduktase und Adrenodoxin, oder es kann nur ein Protein sein, beispielsweise Reduktase.
Unter den menschlichen Genen, die Cytochrom P 450-Enzyme kodieren, wurde das Aromatase-Gen CYP19 isoliert, das für die Synthese eines Enzyms verantwortlich ist, das den Übergang von Androgenen zu Östrogenen in verschiedenen Geweben, einschließlich Brustgewebe, katalysiert. Dieses Gen weist 11 DNA-Polymorphismen auf, die mit einer Zunahme oder Abnahme seiner Expression verbunden sind (Allele: TTTA 7, TTTA 11 TTTA 12 usw.).
Ein weiteres Gen dieses Systems - das CYP1A1-Gen kodiert für Cytochrom P 450 1A1, das Kohlenwasserstoffe metabolisiert Tabakrauch und hat auch seine eigenen Polymorphismen (T623C, A4489G).
Das CYP17-Gen kodiert für Cytochrom P 450 c17alpha. Er beteiligt sich an der Biosynthese von Sexualsteroiden.
Es sollte beachtet werden, dass die Lokalisation von Cytochrom P 450 in Lebermikrosomen diese mit Elektronen aus dem Protein Flavoprotein (Cytochrom P 450 Reduktase) versorgt und Cytochrom P 450 selbst die aktive Form des Proteins Hämoprotein ist. Die Stabilität dieses Proteins wird in diesem Fall durch die Lipiddoppelschicht der Membran gewährleistet, die aus Phosphatidylcholin oder einem Gemisch mikrosomaler Phospholipide besteht.
Es wurde festgestellt, dass Cytochrom P 450, wenn es mit einem Xenobiotikum interagiert, inaktiviert wird, wobei es von einer aktiven Form von Cytochrom P 420 in eine inaktive übergeht. Darüber hinaus kann diese inaktive Form durch Inkubation isolierter Lebermikrosomen bei einer Temperatur von 37 ° C erhalten werden.
Bei den Reaktionen „Xenobiotikum-Cytochrom P 450“ wirken alle Xenobiotika entweder als exogene Substrate (Karzinogene, Medikamente, Lebensmittelzusatzstoffe, Toxine, Gifte) oder als endogene Substrate (Fettsäuren, Prostaglandine, Steroide, Cholesterin). Moleküle dieser Substrate binden in den ER-Membranen mit Cytochrom P 450-Molekülen, was eine Kette von LPO-Reaktionen und anderen Veränderungen verursacht. Sie können jedoch sowohl direkt als auch indirekt agieren. Im zweiten Fall werden obligate und fakultative Xenobiotika unterschieden.
Obligatorische Xenobiotika, B. Phenobarbital, haben eine direkte toxische Wirkung auf Hepatozyten (die Wirkung ist dosisabhängig), was aufgrund der Induktion von Leberenzymen zu einer Hepatomegalie führt.
Das Xenobiotikum Cortison wiederum induziert durch Umwandlung in hochtoxische Zwischenprodukte wie Salicylate und polyzyklische Kohlenwasserstoffe eine Fettleberinfiltration oder Steatose.
Darüber hinaus führt die direkte Wirkung von obligaten Xenobiotika oder deren Metaboliten zu einer Störung des Bilirubinstoffwechsels (in allen Phasen seiner Synthese vom Häm bis zur Ausscheidung in die Gallengänge), zur Erweiterung der Sinusoide und zum Verschluss von Lebervenen, was zu Nekrose und weniger oft zur Apoptose von Leberzellen.
Optionale Xenobiotika immunvermittelte Reaktionen verursachen, die einer Idiosynkrasie oder einer Unverträglichkeit gegenüber Verbindungen zugrunde liegen, wie z. B. allergische Reaktionen auf Arzneimittel.
Das Molekül des Cytochrom P 450 selbst wird durch zwei Schädigungsmechanismen beeinflusst: direkt das Protein durch freie Radikale und die Lipidumgebung des Proteins in der Membran.
Im Allgemeinen umfasst der Mechanismus der Entgiftung von Xenobiotika in der Leber unter Beteiligung von Cytochrom P 450 drei Phasen.
Phase Eins- Kontakt des Xenobiotikums mit ER-Enzymen (mikrosomale Fraktion der Hepatozyten), Monooxygenasen, Cytochrom-c-Reduktasen, reduziertem NADP (als Cofaktor) und Cytochrom P 450. Während des Kontakts wird das Xenobiotikum unter Bildung (Freisetzung) von funktionellen . verändert Gruppen.
Zweite Phase- Biotransformation oder Konjugation (Verbindung) eines xenobiotischen Moleküls mit endogenen Molekülen unter Beteiligung von zwei Enzymen: UDP-Glucuronyltransferase und Glutathion-S-Transferase, die eine Entgiftung oder Verringerung der Toxizität mit beschleunigter Elimination des Xenobiotikums bewirken (siehe unten). In dieser Phase ist die mikrosomale Glutathion-D-Transferase direkt mit dem Cytochrom-P-450-Molekül assoziiert, was zur schnellen Inaktivierung von Stoffwechselzwischenprodukten oder Reaktionsmetaboliten des Xenobiotikums beiträgt.
Dritte Phase- aktiver Transport und Ausscheidung (Evakuierung) von xenobiotischen Produkten, die mit Hilfe von Cytochrom P 450 mit Galle und Urin transformiert wurden.
Somit ist die Inaktivierung von Cytochrom P 450 ein Indikator für eine Schädigung der ER-Membranen in der Leber. Gleichzeitig kann die Inaktivierungsrate von Cytochrom P 450 anhand der Wiederherstellung oder Reparatur beschädigter Zellmembranen beurteilt werden.
Entgiftung von Phospholipidhydroperoxiden
Das System zur Entgiftung von Phospholipidhydroperoxiden (LOOH) umfasst drei Glutathion-abhängige Enzymkomplexe, die eine Zwei-Elektronen-Reduktion von LOOH durchführen: Glutathionperoxidase, Phospholipid-Peroxid-Glutathion-Peroxidase, sowie Selen-freie Glutathion-Komplex-Transferase, Typ alpha (-SH-S). Diese Enzymkomplexe sind Antioxidantien - Quinolam(Enolam), kommen in allen Zellen, Geweben und Organen vor, interagieren mit den Vitaminen E, C und Ubiquinol (Coenzym Q) und sind universelle Systeme zur Bindung aktiver Metaboliten. Alle drei Glutathion-abhängigen antioxidativen Systeme stehen in Zusammenhang mit enzymatisches Redoxsystem von Glutathion(FRSH), das an LPO und der Proliferation immunkompetenter Zellen beteiligt ist. FRSH kontrolliert die Teilung und Aktivität von Prooxidantien, hemmt radikalische Stufen der Peroxidation, zerstört (nicht radikalisch) Peroxide und interagiert mit Nicht-Peroxid-Produkten der Peroxidation.
Die Eigenschaften des Redoxsystems werden durch den Gleichgewichtszustand „Oxidation-Reduktion“ bestimmt (siehe Kapitel 9).
Das Aktivitätsniveau von Glutathion-abhängigen Enzymen in verschiedenen Zellen und Geweben spiegelt den Zustand des gesamten antioxidativen Systems wider, da diese Enzyme notwendig sind, um vor ROS-Aggression, Kettenreaktionen freier Radikale zu schützen und Prozesse zu verbessern
Die Induktion von Glutathion-abhängigen Enzymen ist gekennzeichnet durch einen „Überschuss“ ihrer Aktivität und Ausgewogenheit in Bezug auf die Sauerstoffversorgung von Zellen, Geweben und Organen.
Eine besondere Rolle kommt dem GST-Komplex zu, der 21 Enzyme umfasst, davon 16 echte zytosolische Enzyme, die in 6 Unterfamilien (Klassen) eingeteilt sind: Alpha, Mu, Omega, Pi, Theta und Zeta. Jede Klasse ist ein Dimer, das aus zwei gleichen oder unterschiedlichen Untereinheiten (mit ihren eigenen aktiven Zentren) besteht, die unabhängig voneinander agieren. Jede Untereinheit hat 2 Domänen, die durch eine kurze Linkerkette von 6 Aminosäureresten verbunden sind.
Jede der sechs Enzymklassen wird durch Gencluster kodiert.
Alpha-Klasse- der Gencluster befindet sich am 6p12-Locus und enthält die Gene GSTA1, GSTA2, GSTA3, GSTA4 und GSTA5 und 7 Pseudo-
Neu Gene dieser Klasse sind am Austausch von Bilirubin, Häm und Steroidhormonen beteiligt. Die Gene GSTA1 und GSTA2 werden in allen Geweben exprimiert. Das GSTA3-Gen wurde aus einer 8-9 Wochen alten Plazenta isoliert. Das GSTA5-Gen wurde nicht aus Geweben isoliert.
Mu-Klasse- der Cluster wird auf Locus 1p13.3 abgebildet. Enthält 5 Gene: GSTM1-Gen (dargestellt durch drei allelische Varianten: A, B und O; exprimiert in Leber- und Blutzellen); Gen GSTM2 (nur in Muskeln); Gene GSTM3 und GSTM4 (Hoden und Gehirn); Gen GSTM5 (Lunge, Gehirn, Herz, Hoden) sowie 2 Pseudogene.
Omega-Klasse- der Cluster besteht aus zwei Genen, die am 10q25.1-Locus kartiert sind. Von diesen kodiert das GSTO1-Gen ein einzigartiges Housekeeping-Enzym, das als Reaktion auf oxidativen Stress gebildete S-Thiol-Radikale entfernt. Das zweite Gen ist GSTO2 (wenig untersucht). Die Transkripte dieser Gene sind in allen Geweben weit verbreitet. Ihre maximale Expression wird in Leber, Skelettmuskulatur und Herz beobachtet; minimale Expression ist charakteristisch für Lunge, Gehirn und Plazenta.
Klasse pi– repräsentiert durch ein GSTP1-Gen, das auf den 11q13-Locus kartiert ist, und das GSTPP-Pseudogen, das auf den 12q13-q14-Locus kartiert ist. Das GSTP1-Gen weist 3 allelische Varianten auf, die mit dem Polymorphismus von Nukleotidsequenzen in den Codons 105 und 114 verbunden sind, die mit den aktiven Zentren von Enzymen verwandt sind. Dieses Gen ist ein Inhibitor von Proteinkinasen, die an der Zellproliferation und Apoptose beteiligt sind.
Theta-Klasse- sein Cluster umfasst 2 Gene (GSTT1 und GSTT2), die am Locus 22q11.23 kartiert sind. Das GSTT1-Gen existiert in zwei allelischen Varianten (aktiv und null). Das GSTT2-Gen ist kaum bekannt.
Zeta-Klasse- repräsentiert durch ein Gen GSTZ1, das dem Locus 14q24.3 zugeordnet ist. Das Gen wird in Leberzellen und in geringerem Maße in Skelettmuskelzellen und Hirngewebe exprimiert. Beteiligt sich am Austausch von Phenylalanin und Tyrosin.
Es sollte beachtet werden, dass die Enzyme des GST-Komplexes, die von allen angegebenen Genklassen synthetisiert werden, auf der Grundlage zahlreicher Mechanismen funktionieren, darunter:
Katalytische Inaktivierung eines Xenobiotikums durch seine Kombination mit Glutathion oder Substitutionsweg an elektrophilen Kohlenstoffatomen (Halogen und Nitroalkane), Stickstoff (Trinitroglycerin), Schwefel (Thiocyanate und Disulfite) und Phosphor (Methylparathionin);
Nicht-katalytische Konjugation (Bindung) an das Substrat; 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol gilt als klassisches Substrat; dieser Weg ist auch typisch für die Konjugation von Oxyarenen, Alkenepoxiden, Nitronium- und Carboniumionen sowie freien Radikalen;
Reduktion organischer Hydroperoxide (Lipid- und DNA-Hydroxyperoxide) zu Alkoholen durch Expression der Aktivität von GSH-Peroxidase oder reduziertem Glutamin;
Isomerisierung von Prostaglandinen und Steroiden;
Teilnahme am Stoffwechsel anderer exogener Verbindungen.
Reduziertes Glutathion(GSH) bezieht sich auf Thiole mit niedrigem Molekulargewicht, die in den meisten proliferierenden Zellen dominant sind. Dieses Tripeptid (L-Gamma-Glutamyl-L-Cysteinylglycin) ist am Glutamyl-Zyklus beteiligt und neutralisiert verschiedene toxische Verbindungen, indem es diese in Thioester umwandelt (Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel- und Kohlenstoffatome werden angegriffen). Glutathion-Konjugate gehen im weiteren Stoffwechsel in Mercaptursäuren (Mercaptane) über und werden vom Körper ausgeschieden (ca. 0,1 mmol pro Tag).
Der GSH-Wert kann bei Krebspatienten nachgewiesen werden, bei denen die Konzentration an freiem Glutamin von den Eigenschaften von Zytostatika abhängt, die seine Reserven erschöpfen und Tumorzellen lysieren. Darüber hinaus hängt während der Zellproliferation und des Tumorwachstums eine Abnahme der Konzentration von Thiolen und Disulfiten von der Aufrechterhaltung des Stoffwechselgleichgewichts, der Synthese von Glutathion-abhängigen Enzymen und der Entfernung von Phospholipidhydroperoxiden ab.
Die LOOH-Entgiftung verläuft nach Schemata, die die Wirkung vorsehen:
Peroxid-Ca 2+ -stimulierte PLA 2 und Glutathionperoxidase entlang des Hydrolyse-Reduktions-Reparatur-Weges;
PL-Peroxid-Glutathion-Peroxidase und Phospholipase A 2 entlang des "Recovery-Hydrolysis-Repair"-Weges.
Beide Schemata führen zur Reacylierung von Lysophospholipiden.
Gleichzeitig kann es bei einem Ungleichgewicht zwischen endogenen Oxidantien und Antioxidantien zu einem Überschuss an ROS und nachfolgendem oxidativem Stress kommen. Der Mechanismus dieses Stresses, der als "oxidativer Stresssignalisierung" bezeichnet wird, begleitet LPO-Reaktionen als Reaktion auf einen alarmierend hohen oder niedriges Niveau Oxidationsmittel.
Signalisierung von oxidativem Stress
Mithilfe des oxidativen Stress-Signalings (OSS) produziert die Zelle einen Überschuss an Antioxidantien und aktiviert gleichzeitig eine oder mehrere Enzymklassen: reduziertes Glutathion (siehe oben), Häm-Oxygenase-1, Glutathion-Peroxidase, Katalase, SOD und Ferritin .
Es wurde gezeigt, dass OSS die Expression von Genen stimuliert, die Apoptose, Zytoprotektion und andere zelluläre Effekte kontrollieren.
OSS umfasst Proteinkinase C (PK C), MAPK, Hydrolasen sowie Phospholipasen C (PL C) und A 2 (PLA 2), aktiviert durch Ca 2 + -Ionen. Die frühen Mediatoren dieser Enzyme sind LOOH (siehe oben), die als "Mimetika" der Wirkung von Wachstumsfaktoren (TNF-alpha), Zytokinen und anderen Agonisten gelten, was auf eine Rolle von Oxidationsmittelderivaten als sekundäre Botenstoffe hinweist (siehe Kapitel 8).
Beispielsweise initiiert die oxidative Aktivierung von Phospholipasen durch die Freisetzung von Arachidonsäure die Bildung von eicosanoiden Lipidmediatoren und Lysophospholipiden, die als Verbindungen wirken, die direkt wirken oder zu PAF und anderen Effektoren metabolisiert werden.
Nach der Einwirkung von Oxidantien, die die Zellmembranen besonders stark schädigen, ist das Schicksal der Zelle zweigeteilt: Entweder Überleben oder Tod durch Apoptose oder Nekrose – es hängt von der Schwere des „oxidativen Stresses“ ab. So kann beispielsweise mit Hilfe von endo- oder exogenen Peroxiden die Apoptose in Leukämiezellen ausgelöst werden. Es gibt auch einen möglichen Aktivierungsmechanismus unter der Wirkung der zytosolischen Phospholipase (siehe Kapitel 9), der Arachidonoylphospholipide beeinflusst, einschließlich der PKC-katalysierten Phosphorylierung des Enzyms und seiner Translokation in der Membran (durch MAPK-Aktivierung). Dieser Mechanismus hängt wenig von Ca 2+ ab und wird daher nur bei einer relativ geringen Lipidperoxidation aktiviert.
Superoxid-Dismutase-System
Das SOD-Enzym katalysiert die Wechselwirkung zweier Superoxid-Radikale unter Bildung von Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) und molekularem Sauerstoff (O 2). Diese Reaktion wurde genannt Dismutationsreaktionen(siehe Kapitel 6 und 9).
Das SOD-1-Gen ist auf Chromosom 21 lokalisiert, und diese Lokalisierung wurde in der Literatur oft diskutiert, um die Ursachen und Mechanismen der Entwicklung des Down-Syndroms (als Dreifachdosis des Gens) zu erklären. Dies wurde jedoch nicht bestätigt. Es stellte sich heraus, dass in den Mitochondrien normaler Zellen, die als Quelle für ATP und ROS dienen, die zulässigen
Letzteres wird durch ein schützendes Enzymsystem aufrechterhalten, das neben SOD auch Cytochromoxidase, Glutathionperoxidase und einige andere Enzyme umfasst.
Antioxidative Rolle des Blutes
Wie in den Kapiteln 8 und 9 erwähnt, spielen Signalmechanismen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Membranenzymaktivität. Die meisten dieser Mechanismen werden durch das Blut realisiert, das seine eigene Antioxidase-Aktivität besitzt und in direktem Kontakt mit den strukturellen Komponenten der Wände von Blutgefäßen steht, die hauptsächlich durch Endothelzellen repräsentiert werden.
Die Regulation der Enzymaktivität über die Struktur- und Funktionselemente des Blutes lässt sich am Beispiel eines "Gewebefaktors" bzw. eines bei der Arteriosklerose vorkommenden Transmembran-Glykoproteins in der Adventitia von Blutgefäßen und dem inneren Bereich einer atherosklerotischen Plaque demonstrieren. Dieser Faktor wird auf den Membranen von Monozyten und Makrophagen exprimiert und ist an der Entzündung und Destabilisierung von Plaque beteiligt; es ist besonders empfindlich gegenüber der Wirkung von Inhibitoren, die von Endothelzellen von Blutgefäßen während der Signalübertragung synthetisiert werden.
Es ist wichtig zu beachten, dass Sauerstoff durch das Blut transportiert wird, die bakterizide Wirkung von Fresszellen ausgeübt wird, sich Ionen von Metallen mit variabler Wertigkeit bewegen, die Katalysatoren oder Inhibitoren von Oxidations-Reduktions-Prozessen sind. Gleichzeitig ist Blut gewissermaßen ein limitierendes Glied im antioxidativen Abwehrsystem, da es im Vergleich zum intrazellulären Gehalt wenige hochmolekulare Antioxidantien enthält, was zur Intensivierung oxidativer Reaktionen beiträgt und Reduktionsreaktionen nicht begünstigen.
Zellmembranreparaturmechanismen
Biochemiker schlagen seit langem die Anpassung von Zellmembranen an Schäden vor. Dies wird beispielsweise durch Daten zur Reduktionsarbeit von Enzymen durch Reaktionen von PK C, MAPK und mitochondrialen ATP-abhängigen Calciumkanälen gestützt. Insbesondere die Öffnung von Calciumkanälen in mitochondrialen Membranen verursacht deren Depolarisation, wodurch die übermäßige Ansammlung von Ca 2+ reduziert wird.
Es ist dieser Mechanismus, der die Zellregeneration beim Myokardinfarkt fördert.
Die Wiederherstellung der Enzymaktivität wurde experimentell gezeigt. in vitro geschädigte Membranen von Mikrosomen in Rattenleber bei Zugabe von PC oder einer Mischung aus PC und Lyso-PC. Die Zugabe dieser Phospholipide stellte die Aktivität von Glucose-6-Phosphatase, Ca 2 + -, Na + -, K + -ATPasen, Stearoyl-CoA-Desaturase, Lipase, UDP-Glucuronyl-Transferase, Phenylalanin-Hydroxylase und Cytochrom-L5-Reduktase wieder her.
Ähnliche Ergebnisse wurden für Sphingomyelinasen des Gehirns, Beta-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase von Herzmitochondrien und Acetylcholinesterase von Rindererythrozyten erhalten.
Im Zusammenhang mit diesen Daten wurde angenommen, dass die Wiederherstellung der Aktivität von Membranproteinen durch Phospholipide unspezifisch ist, da die meisten Enzyme bestimmte Arten von Phospholipiden nicht benötigen und daher verschiedene Arten von letzteren (oder deren Mischungen) eine reduzierende Wirkung haben können Funktion für sie.
Die Tatsache der Beteiligung von Membranphospholipiden an der Wiederherstellung der Aktivität von Enzymproteinen ist von Interesse. Gleichzeitig ist die Fettsäurezusammensetzung der den Zellen zugesetzten Phospholipide wichtig für die Aufrechterhaltung (und möglicherweise Wiederherstellung) der Aktivität von Membranenzymen. Dies wurde beispielsweise für die Ca 2 + -ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums gezeigt, als der Ersatz von intrinsischen Phospholipiden durch DPPC (Phosphatidylcholin mit einem hohen Gehalt an gesättigten Fettsäuren) die Aktivität im Vergleich zum teilweise delipidierten Enzym um das 8-Fache reduzierte, und beim Ersatz von intrinsischen Phospholipiden durch Dioleyl-PC stieg die Reaktionsgeschwindigkeit dagegen stark an.
Außerdem wurde die Bedeutung der hohen Beweglichkeit der Kohlenwasserstoffketten von Phospholipiden für die Wiederherstellung der Aktivität von Enzymen und das Vorhandensein einer bestimmten Oberflächenladung auf den Membranen festgestellt.
Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt für:
Saure Phospholipide (PS, PI und PA) unter ihrer Wirkung auf die Myosinphosphatase des Kehlkopfes;
Anionische Phospholipide (PS) - bei Einwirkung auf 5-Monodehydrogenase der menschlichen Plazenta.
So können wir derzeit über die unendliche Vielfalt und Bedeutung noch nicht entdeckter, aber anscheinend tatsächlich existierender Mechanismen zur Wiederherstellung struktureller und funktioneller Störungen von Zellmembranen sprechen.
Mutagenesehemmer
Wie in Kapitel 5 diskutiert, ist Mutagenese der Prozess der Bildung von Mutationen in Erbmaterial, der durch die Wirkung verschiedener mutagener Faktoren induziert wird.
Zurück in der Mitte des XX Jahrhunderts. A. Novik und L. Szilard zeigten, dass apurinische Ribonukleoside das Ausmaß spontaner und induzierter Mutationen in E. coli reduzieren, was es ihnen ermöglichte, eine neue Klasse chemischer Verbindungen namens . zu isolieren Antimutagene.
Am Ende des XX Jahrhunderts. S. de Flora und S. Ramel teilten Antimutagene in zwei Klassen ein: extrazellulär (Dismutagene) und intrazellulär.
Extrazelluläre Antimutagene drei Untergruppen umfassen.
Inhibitoren der Resorption von Antimutagenen und ihren Vorläufern (aromatische Aminosäuren, Fettsäuren usw.). Sie verhindern das Eindringen und beschleunigen die Ausscheidung von Mutagenen aus dem Körper.
Hemmstoffe der endogenen Mutagenbildung (Ascorbinsäure, Tocopherol, Phenole, fermentierte Milchprodukte). Sie verhindern oder hemmen Nitrosierungsreaktionen oder verändern die Darmflora.
Mutagendeaktivatoren als Folge physikalischer und/oder chemische Reaktionen(Antioxidantien, Substanzen, die den pH-Wert in biologischen Flüssigkeiten halten und Thiole).
Intrazelluläre Antimutagene umfasst auch drei Untergruppen.
Stoffwechselmodulatoren (Thiole und Phenole). Sie beschleunigen den Transfer von Mutagenen in Nicht-Zielzellen und induzieren einen Entgiftungsmechanismus.
Inaktivatoren reaktiver Moleküle. Sie interagieren mit Elektrophilen, schützen die nukleophilen Regionen der DNA und fangen Sauerstoffradikale ein.
DNA-Replikations- und Reparaturmodulatoren (Natriumarsenit, Vanillin, Protease-Inhibitoren, Cumarin, Thiole, Kobaltchlorid). Sie erhöhen die Replikationsgenauigkeit, erhöhen die Reparatureffizienz und verhindern Reparaturfehler.
Wie aus dieser Klassifikation hervorgeht, kann dieselbe Verbindung mehreren Gruppen angehören, beispielsweise Thiolen.
Neben extrazellulären und intrazellulären Antimutagenen isolierte B. Stavrik 1992 aus verschiedenen Nahrungsmitteln mehr als 25 darin enthaltene Antimutagene oder Chemopreventer. Zu dieser Gruppe gehören Vitamine, Fettsäuren, Kalzium, Karo-
Noide, Cumarine, Ballaststoffe, Pflanzensäuren, Selen, Flavonoide und Chlorophyll.
Pflanzliche Antimutagene umfassen grüne Paprika, Kohl, Minzblätter, Zwiebeln, Pflanzensamen und Äpfel.
Die Wirkung von Antimutagenen ist spezifisch: Sie zeigt sich mit hoher Selektivität und ist dosisabhängig. In diesem Fall können einige Antimutagene Inhibitoren von Mutagenen sein, die entgegengesetzte co-mutagene Wirkung haben oder ihre Wirkung kann sich überhaupt nicht manifestieren. Zu solchen Antimutagenen gehören insbesondere Vitamin C,
Die Möglichkeit, Zellen einiger Gewebe mit Hilfe von Antimutagenen bei gleichzeitiger Potenzierung mutagener Wirkungen in Zellen anderer Gewebe zu schützen, ist nicht ausgeschlossen.
Im Allgemeinen ist die Frage nach der Wirksamkeit von exogenen und endogenen Korrektoren der Mutagenese noch offen.
Diesbezüglich wenden wir uns der Betrachtung der bekannteren und in der wissenschaftlichen und pädagogischen Literatur viel diskutierten Reparaturmechanismen in der geschädigten Zelle zu.
Wiederherstellung der DNA-Struktur durch Reparaturmechanismen
Wie Sie wissen, haben Zellen eine wiederherstellende Fähigkeit oder die Fähigkeit, Schäden am DNA-Molekül zu korrigieren und zu beseitigen (reparieren), wodurch seine ursprüngliche Struktur wiederhergestellt wird. Als Ergebnis bleibt während der Replikation, Transkription und Translation nur eine begrenzte Anzahl von Mutationen erhalten.
Wird die Mutation jedoch nicht erkannt, wird die pervertierte Information in mRNA transkribiert und in Form eines defekten Proteins exprimiert. Die Folgen eines solchen Ereignisses für die Zelle sind oft unbedeutend, manchmal jedoch äußerst unerwünscht, und dies hängt von den Funktionen des defekten Proteins ab.
Gegenwärtig sind zahlreiche Reparaturmechanismen gut untersucht, die sowohl seit der klassischen Genetik bekannt sind (Photoreaktivierung, Reparatur von Thymindimeren; Exzisionsreparatur; SOS-Reparatur) als auch in letzten Jahren(siehe unten).
Fassen wir die Merkmale dieser Mechanismen zusammen, können wir feststellen, dass die Reparatur verschiedener Arten von Schäden im DNA-Molekül in mehreren Stufen erfolgt:
Erster Schritt- Dies ist die Feststellung des Schadens und die Bestimmung seiner Art;
zweite Phase- Dies ist die Aktivierung von Enzymen, die entweder den Schaden direkt in seinen ursprünglichen Zustand überführen oder (wenn eine direkte Wiederherstellung nicht möglich ist) den beschädigten Bereich unter Bildung einer Lücke ausschneiden.
Im letzteren Fall werden zwei weitere Stufen hinzugefügt:
dritter Abschnitt- dies ist die Synthese eines neuen Abschnitts des DNA-Moleküls (anstelle des beschädigten);
vierte Stufe- Dies ist das Einbetten einer neuen Site in eine Lücke.
Photoreaktivierung oder Reparatur von Thymindimeren
Unter Einwirkung von ultravioletter Bestrahlung in einem DNA-Molekül kann eine kovalente Vernetzung zweier benachbarter Pyrimidine (zwei Thymine), die sich in verschiedenen Strängen des Moleküls befinden, auftreten. Dabei entstehen Thymin-Dimere (Cyclobutan-Ring), die die DNA-Replikation blockieren. Während der Reparatur von Thymindimeren verbindet sich das Enzym, das sie „erkennt“, die Photolyase, mit ihnen und bildet einen einzigen Komplex. UFO aktiviert dieses Enzym und der Cyclobutanring wird gebrochen, um zwei separate Thymine zu bilden. Dieser Mechanismus wurde 1949 von A. Kellner benannt Photoreaktivierung.
Desaminierung (Methylierung) und fehlgepaarte Basenreparatur
Wie in Kapitel 6 besprochen, während Desaminierung Adenin wird in Hypoxanthin umgewandelt, das Wasserstoffbrücken mit Cytosin bildet. Guanin wird in Xanthin umgewandelt, das Wasserstoffbrücken mit Thymin bildet. Thymin kann nicht desaminiert werden (die einzige stickstoffhaltige Base in der DNA). Wenn Cytosin metabolisiert wird, wird Uracil gebildet. Wenn die Desaminierungsprozesse dieser stickstoffhaltigen Basen gestört sind, erscheinen irrtümlich oder falsch gepaarte Basen im DNA-Molekül. Anstelle von AT-Paaren in der DNA-Kette werden also GT-Paare gebildet und anstelle von GC-Paaren werden GA-Paare gebildet - das sind Paarungsfehler. Sie werden durch zwei Mechanismen beseitigt: GT-Mismatch-Reparaturen und GA-Mismatch-Reparationen bzw. Teilnehmer an diesen Reparaturmechanismen können sein:
Proteinprodukte von vier Genen der Mut-Familie: H, L, S und U;
Helikaseproteine;
DNA-Polymerasen, die die Eigenschaft haben, nach dem Einfügen des nächsten Nukleotids in den wachsenden DNA-Strang "einen Schritt zurück zu machen" und das letzte Nukleotid herauszuschneiden, wenn es nicht zum Nukleotid im Matrizen-DNA-Strang komplementär ist, d.h. in der Lage zu korrigieren
Paarungsfehler;
Adenosintriphosphatase (ATP);
Desoxynukleotid-Phosphatase (dNTP).
Es ist zu beachten, dass die Mechanismen Nichtübereinstimmung Reparationen arbeiten auf einem Tochter-Thread und ersetzen nur darin nicht komplementäre Basen.
Kurz nach dem Ende der Replikation binden Methylaseenzyme Methylgruppen an Adenine in den GATC-Sequenzen (Guanin-Adenin-Thymin-Cytosin).
Bei der nächsten Replikation sind die DNA-Stränge unterscheidbar: Der mütterliche Strang enthält methylierte Adenine und in den Tochtersträngen sind die Adenine bis zum Ende der Replikation noch nicht methyliert. Ihre Methylierung beginnt erst nach dem Ende der Replikation. Obwohl die Adenine nicht methyliert sind, müssen die Zellen daher Zeit haben, die Fehlpaarung zu "reparieren". Die Reparatur fehlgepaarter Basen kann während der DNA-Deaminierung erfolgen, wenn das N-Glycosylase-Enzym eine solche Base erkennt, die kovalente N-glycosidische Bindung bricht und sie entfernt. Außerdem kann während der DNA-Methylierung eine Fehlpaarungsreparatur durchgeführt werden (siehe Kapitel 7).
Ist die Bildung klassischer "Watson-Crick"-Basenpaare generell schwierig, so können bei der Replikation Paarungsfehler (Replikationsfehler) und auch Mismatching auftreten. Um sie zu eliminieren, sind andere Enzyme beteiligt: Zuerst spaltet die Endonuklease einen DNA-Strang an Stellen, an denen AT- oder GC-Paare keine Zeit hatten, sich zu bilden, dann spaltet die Phosphodiesterase jene Zucker-Phosphat-Gruppen (AP-Stellen) an diesen Bruchstellen ab, zu denen Basen sind nicht angebracht. Die Lücken in der Molekülkette (ein Nukleotid groß) werden mit DNA-Polymerase I aufgebaut, wonach das Ligase-Enzym die DNA-Enden näht und den ursprünglichen Zustand des Moleküls wiederherstellt.
Alkylierung und Reparatur von О 6 -alkyliertem (methyliertem) Guanin und О 4 -alkyliertem Thymin
Alkylierung - dies ist die Anlagerung von Alkylseitengruppen (Methyl, Ethyl, Propyl oder Butyl) an die Purin- oder Pyrimidinbasen des DNA-Moleküls unter Einwirkung einer Reihe chemischer Mutagene (Alkylierungsmittel). Zum Beispiel alkyliert (methyliert) Methylnitroso-Guanit Guanin durch Anhängen einer Methylgruppe daran.
Während Reparatur von О 6 -alkyliertem Guanin(ca. 6 meH) wird die Methylgruppe von Guanin aufgrund des an das sechste Atom gebundenen Sauerstoffs abgespalten, und an diesem Punkt wird die DNA-Struktur wiederhergestellt. Dieser Mechanismus wurde von I.A. Rapoport im Jahr 1944
Es wurde festgestellt, dass während der Alkylierung Proteine in Zellen synthetisiert werden - Methyltransferasen, die ihre Methylgruppen von modifiziertem Guanin abfangen und die ursprüngliche DNA-Struktur wiederherstellen. Außerdem können die Methyltransferasen, die solche Gruppen eingefangen haben, diese nicht mehr loswerden, was darauf hindeutet, dass sie nicht zu der Klasse von Enzymen gehören, die sich im Verlauf zahlreicher Reaktionen nicht verändern. Zusätzlich zu diesem Mechanismus Reparatur von О 4 -alkyliertem Thymin(O 4 -alT). Wenn wir also davon ausgehen, dass für jeden Akt der direkten DNA-Reparatur neue Proteinmoleküle benötigt werden, dann ist die Zelle bei einer Schädigung durch Alkylierungsmittel gezwungen, ihre Synthese im Verhältnis zu organisieren: ein Molekül pro Schädigung. Daher sind die Prozesse der DNA-Schadensbildung und deren Reparatur miteinander verbunden. Typischerweise sammeln sich Tausende dieser Moleküle innerhalb der Zelle an. Beispielsweise können sich in einem Zellzyklus, der in Escherichia coli 30 Minuten lang abläuft, etwa 3000 Methyltransferasen ansammeln, die 3000 DNA-Schäden neutralisieren können.
Apurinisierung und Exzisionsreparatur
Apurinisierung - dies ist die Bildung von AP-Stellen in der Nukleotidkette
Wie Sie wissen, verliert jede somatische Zelle während ihrer Funktion etwa 10.000 Purine und Pyrimidine pro Tag, und als Ergebnis werden Apurin-Sites oder Zucker-Phosphat-Gruppen ohne Basen (AP-Sites) in ihrem DNA-Molekül gebildet. Wenn die AP-Sites nicht korrigiert würden, gäbe es eine Katastrophe.
Im Zuge der Eliminierung von AP-Stellen brechen Insertaseenzyme die kovalente N-glykosidische Bindung zwischen der Base und Desoxyribose, und dann wird eine direkte Insertion von Purinen durchgeführt. Dieser Mechanismus wurde 1979 von T. Lindahl entdeckt.
Ursachen der Apurinisierung: Temperaturanstieg, pH-Änderung, ionisierende Strahlung.
Wenn die Zelle den Schaden an den Basen und Nukleotiden im DNA-Molekül mit den obigen Reparaturmechanismen nicht bewältigen kann, kommen komplexere Reparaturmechanismen ins Spiel, von denen einer die Exzisionsreparatur ist.
durchgeführt durch Exzision (Exzision) der beschädigten Base im Nukleotid oder einer ausgedehnteren Region des Moleküls.
Exzisionsreparatur Basenschädigung erfolgt mit Hilfe von DNA-Glykosylasen, die Basenschäden durch Methylierung, Oxidation, Reduktion, Desaminierung, Anlagerung von Formidgruppen und andere Reaktionen erkennen.
Die Familie der DNA-Glykosylasen umfasst 11 Arten von Enzymen, die an Substrate oder beschädigte Ziele binden: ura- (enthält Uracil); hmu-(Oxymethyluracil); 5-tC- (Methylcytosin); Hx- (Hypoxanthin); 3ntA-, Typ I (3-Methyladenin) und Typ II (enthält Methyladenin, 7-Methylguanin oder 3-Methylguanin); FaPy- (Reste von Formidopyrimidinen oder 8-Hydroxyguanin); 5,6-HT oder Endonuklease III (5,6 hydratisierte Thyminreste); PD- (Dimere von Pyrimidinen); Thymin-Fehlpaarung (enthält ein nicht komplementäres GT-Basenpaar); mutY-Substrat (enthält ein nicht komplementäres GA-Paar).
DNA-Glykosylasen heften sich an Läsionen, brechen die glykosidischen Bindungen zwischen der modifizierten Base und Desoxyribose und bilden dadurch AP-Stellen.
Die resultierenden AP-Stellen werden vom AP-Endonuklease-Enzym (das eine Kette innerhalb eines DNA- oder RNA-Moleküls brechen kann) erkannt. Nach dem Auftreten der Lücke tritt das Enzym Phosphodiesterase in Aktion, das aus der DNA jene Zucker-Phosphat-Gruppe spaltet, an die die Base nicht mehr gebunden ist.
Das Ergebnis ist eine Lücke in einem DNA-Strang von einer Größe von einem Nukleotid. Ein intaktes Nukleotid befindet sich gegenüber der Lücke im gegenüberliegenden DNA-Strang, und bereits ein anderes Enzym (DNA-Polymerase I) fügt ein komplementäres Nukleotid in die Lücke ein und bindet es an das freie 3"-OH-Ende. Dieses Ende des DNA-Strangs und die 5"-Ende bildeten sich früher während des Bruchs untereinander unter der Wirkung der Polynukleotidligase. Danach gilt die gesamte Struktur als vollständig wiederhergestellt: Die falsche Base wird entfernt, das Zuckerphosphat, an dem diese Base befestigt war, wird herausgeschnitten, die Lücke wird mit dem richtigen Nukleotid gefüllt und der Einzelstrangbruch wird wiederhergestellt.
Exzisionsreparatur beschädigter Nukleotide
Der Mechanismus der Exzisionsreparatur ist ein komplexerer und energieaufwendigerer Mechanismus, der mit der Exzision nicht nur einer beschädigten Basis, sondern eines erheblichen Teils der Kette verbunden ist.
DNA vor und nach dem Schaden. In Escherichia coli wird eine solche Reparatur durch einen Multienzymkomplex von Endonukleasen durchgeführt, der von drei Genen der Ultraviolett-Reparatur oder uvr-Genen (A, B und C) kodiert wird und als Komplex bezeichnet wird - Excinuklease (Fig. 50). Dieser Mechanismus wurde von R. Setlow und V.N. Soifer im Jahr 1970. Es umfasst die folgenden Phasen:
Erkennung von Schäden durch uvr-Proteine A und B;
Biegen des DNA-Moleküls und Ändern der Konformation des uvr B-Proteins;
Herstellung von zwei einzelsträngigen DNA-Schnitten auf beiden Seiten des Schadens unter Verwendung der uvr-Proteine B und C;
Entweben von DNA im Bereich zwischen zwei Schnitten unter Verwendung von uvr D Protein (Helikase II);
Ablösen des den Defekt enthaltenden 12-Nukleotid-(12-mer)-Fragments unter Bildung einer Lücke, wodurch die Energie eines ATP-Moleküls verbraucht wird;
Aufbau der entstandenen Lücke mit DNA-Polymerase;
Verbindung der freien Enden des Zucker-Phosphat-Rückgrats der DNA mittels DNA-Ligase.
Beim Menschen existiert ein ähnlicher Mechanismus. Gleichzeitig besteht sein Excinuklease-Komplex aus 17 Proteinen und baut eine Lücke
Reis. 50. Mechanismus der Exzisionsreparatur bei E. coli. (von Elliot W., Elliot D., 2002)
verläuft unter Beteiligung von DNA-Polymerasen OuE, und die aus dem beschädigten DNA-Strang geschnittene Region ist 29 Nukleotide lang (statt 12 in Escherichia coli).
Die Reparatur beschädigter Nukleotide beinhaltet die Fehlpaarung oder Reparatur nicht komplementärer (nicht kanonischer) oder nicht Watson-Crick-Basenpaare – dies ist die sogenannte Fehlpaarungsreparatur (siehe oben).
Reparatur von einzelsträngigen und doppelsträngigen DNA-Brüchen
Zusätzlich zu den oben diskutierten Reparaturmechanismen sind Mechanismen zur Wiederherstellung von Einzelstrangbrüchen (Bindungsbrüche zwischen Basen in einem Strang eines DNA-Moleküls) und Doppelstrangbrüchen (Bindungsbrüche zwischen Basen in zwei Strängen eines DNA-Moleküls) bekannt ).
Reparatur von DNA-Einzelstrangbrüchen
Reparatur von DNA-Einzelstrangbrüchen - das direkte Wiedergutmachung. Es wird als Reaktion auf die Wirkung ionisierender Strahlung verursacht und wird durch die sequentielle Wirkung von Enzymen bereitgestellt: 3'-Phosphodiesterase, DNA-Polymerase-b und DNA-Ligase (DNA-Polynukleotid-Ligase). Die Reparatur einer solchen Lücke erfolgt mit einem intakten Komplementär DNA-Strang als Vorlage.
Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen
Doppelstrangbrüche in einem DNA-Molekül sind die gefährlichste Art von DNA-Schäden für eine Zelle. Sie führen in der Regel zur Entwicklung einer genetischen Instabilität, dem Auftreten von Punktmutationen und Chromosomenaberrationen und anschließendem Zelltod.
Es gibt zwei bekannte Mechanismen zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen: nicht-homologe Wiedervereinigung abgebrochener Enden und homologe Rekombination.
Nicht-homologe Wiedervereinigung gebrochener DNA-Enden
Zwischen den Enden des Moleküls, die nicht-homologe Nukleotidsequenzen unterschiedlicher Länge oder sehr kurze homologe Bereiche aufweisen, findet eine nicht-homologe Wiedervereinigung von gebrochenen DNA-Enden statt. Dieser Reparaturmechanismus ist nicht unfehlbar und dient oft als Quelle von Punktmutationen, da die Wiederherstellung der ursprünglichen Struktur eines DNA-Moleküls nur möglich ist, wenn die Enden desselben Strangs wieder vereint sind. Wenn diese Bedingung nicht erfüllt ist, bilden sich Chromosomenaberrationen: Deletionen, Duplikationen,
Inversionen, Insertionen und Translokationen (siehe Kapitel 5). Bei Säugetieren erfolgt die nichthomologe Wiedervereinigung unter Beteiligung des Rad50-Proteins, verwandter Proteine, Ku-Faktoren, DNA-Ligase IV und Silencing-Faktoren.
Homologe Rekombination
Der Mechanismus der homologen Rekombination wurde an Drosophila melanogaster untersucht. Es wird davon ausgegangen, dass es in menschlichen Zellen vorhanden sein muss, aber schlüssige Beweise dafür liegen noch nicht vor. Es wird angenommen, dass im Verlauf der homologen Rekombination an einem der DNA-Stränge eine Lücke entsteht, die der Größe des aus Bakterien entfernten Elements (P-Element) entspricht. Die Lücke wird unter Beteiligung einer Kopie des P-Elements auf dem Schwesterchromatid wiederhergestellt und als Matrix für die reparative Synthese verwendet.
Gleichzeitig kann sich während der Replikation gegenüber der unreparierten Stelle eine einzelsträngige Lücke bilden, die ohne Beteiligung eines anderen DNA-Moleküls nicht fehlerfrei korrigiert werden kann.
Daher bietet dieser Mechanismus eine Wiederherstellung nur in Fällen, in denen beide DNA-Stränge beschädigt sind.
Alberts-Proteine und ihre Rolle bei der DNA-Replikation und -Reparatur
1968 wurden Alberts-Proteine oder SSB-Proteine entdeckt, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind. Diese Proteine haben aufgrund der Organisation ihrer Tertiärstruktur die Fähigkeit, elektrostatisch an DNA zu binden. SSB-Proteine enthalten einen Cluster von positiv geladenen Aminosäureresten, aber ihre Gesamtladung bleibt negativ, wodurch sie eine erhöhte Affinität für einzelsträngige DNA haben.
Wenn bei einer Störung der Sekundärstruktur doppelsträngiger DNA in einzelnen Strängen ihrer Helix „geschmolzene Regionen“ entstehen, dann binden Alberts-Proteine daran, sitzen leicht darauf und „begradigen“ sie. Gleichzeitig lassen die SSB-Proteine, die auf den komplementären Ketten des Moleküls sitzen, sie nicht "zusammenbrechen", da sie aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen eine starke negative Ladung haben, eine Affinität zueinander zeigen und den "geschmolzenen Bereich" abdecken. mit einer durchgehenden Schicht - das ist stöchiometrische Proteinmenge. Mit anderen Worten, diese Proteine denaturieren das DNA-Molekül nicht, sondern fixieren nur seinen einzelsträngigen Zustand.
Die Beteiligung von SSB-Proteinen an der Replikation des DNA-Moleküls ist für die Zelle zwingend erforderlich: Sie halten beide Matrixstränge in der Replikationsgabel in einem einzelsträngigen Zustand, schützen jeden Strang vor der Wirkung von Nukleasen und stimulieren selektiv die Arbeit der DNA Polymerase (RNA-Polymerase verwendet keine mit SSB beschichtete einzelsträngige DNA).
Damit ist die Rolle von SSB-Proteinen bei der Reparatur von einzel- und doppelsträngigen DNA-Brüchen vollständig belegt.
Post-replikative (Rekombination) DNA-Reparatur
1968 entdeckten W. Rapp und P. Howard-Flanders mit UFO . behandelte Bakterien post-replikative Reparatur oder Rekombinationsreparatur eines Template-DNA-Strangs, der viele ungeschnittene Thymin-Dimere enthielt, und in dem Moment, in dem die DNA-Polymerase in unverständlicher Weise führte) und die Synthese hinter dem Defekt wieder aufnahm, bis sie über das nächste Dimer "stolperte". Somit enthielten Teile des Tochterstrangs Lücken (die während der DNA-Synthese nicht verdoppelt wurden), während ungeheilte Defekte in den Teilen des Matrixstrangs gegenüber den Lücken verblieben. Darauf folgte eine post-replikative Reparatur beschädigter Bereiche, an der die recA-Proteine, Ligasen und DNA-Polymerase beteiligt waren. Dieser Mechanismus ähnelte dem Rekombinationsmechanismus: Erstens haftete das Proteinmolekül rec A an der Gap-Zone, wo unter seiner Kontrolle eine Rekombination stattfand, bei der ein Teil des komplementären Strangs des Schwesterstrangs in die Gap-Zone transferiert wurde, die Lücke wurde während der replikativen Synthese aufgebaut, und die Ligase verband die Enden der neuen und alten Stränge des Moleküls.
SOS-DNA-Reparatur
Die SOS-DNA-Reparatur ist die letzte Gelegenheit für die DNA einer Zelle, die sich der Replikation mit Schäden nähert, die nicht durch alle oben genannten Reparaturmechanismen beseitigt wurden. In diesem Fall kann die Zelle absterben, da die Replikation beim allerersten nicht reparierten Schaden "blockieren" kann.
Gleichzeitig verfügt die Zelle über einen äußerst riskanten Mechanismus, der für solche Zwecke entwickelt wurde, genannt SOS-DNA-Reparatur. Dieser Mechanismus wurde erstmals 1953 von J. Weigl und
1974 namens M. Radman W-Reaktivierung(Möglichkeit für Thymindimere, bis zur nächsten Replikation zu "überleben"). Im Zuge des SOS-Reparaturmechanismus wird die Synthese von Proteinen induziert, die an den DNA-Polymerase-Komplex binden und seine Arbeit so "grob" machen, dass der geschädigte Komplex in die Lage versetzt wird, einen Tochter-DNA-Strang gegenüber den defekten Gliedern der Matrix-Thread, und gleichzeitig erscheinen viele Fehler auf dem Tochter-Thread (Mutationen). Als Ergebnis wird die Zelle in diesem Stadium vor dem Tod bewahrt und kann eine Mitose bereitstellen, obwohl es Fehler und ein hohes Risiko des Zelltods geben wird.
Es sollte beachtet werden, dass die oben genannten Mechanismen der DNA-Molekülreparatur hauptsächlich mit den Errungenschaften der klassischen Genetik zusammenhängen. Gleichzeitig wurde die allgemeine Liste der DNA-Reparaturmechanismen in den letzten Jahrzehnten dank der Errungenschaften des internationalen wissenschaftlichen Programms „Human Genome“ (siehe Kapitel 1) durch andere, bisher wenig bekannte und neue Mechanismen wesentlich ergänzt.
Gewinnung eines DNA-Moleküls mit in den letzten Jahren entdeckten Mechanismen
Reparaturmechanismus mit Beteiligung des Enzyms Poly-ADP-Ribosapolymerase
Das Enzym Protein Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) ist einer der nuklearen Faktoren, die als erste DNA-Schäden erkennen. Dieser Faktor steuert die Initiierung des DNA-Reparaturmechanismus in lebenden Zellen, ausgehend von der Stelle der DNA-Schädigung, und ist im Multiproteinkomplex (MP-Komplex) enthalten, der auch den XRCC1-Faktor, die DNA-Ligase III und die Beta-DNA-Polymerase umfasst .
Das Vorhandensein von PARP in diesem Komplex stellt sicher, dass alle Beteiligten an der DNA-Reparatur in vivo zu den Stellen der DNA-Schädigung gelangen, was die Wiederherstellung des DNA-Moleküls erleichtert.
Faktor XRCC1, der ein Teil des MR-Komplexes ist, bezieht sich konventionell auf „Gerüst“, der individuell mit jeder Komponente des Komplexes als tragende Molekülstruktur interagiert. Seit der Entdeckung der polyADP-Ribosylierung dieses Faktors in vitro, Es wurde vorgeschlagen, dass PARP die Aktivität des MR-Komplexes durch Modifikation des XRCO-Proteins regulieren kann in vivo, was die Interaktion mit anderen Komponenten des Komplexes stört. Diese Annahme wurde durch die Daten gestützt, dass eine Überexpression des XRCC1-Faktors die Aktivität von PARP in vivo unterdrückt.
Diese Hypothese wird derzeit untersucht; es wird durch die Daten bestätigt, dass die im MP-Komplex enthaltene DNA-Ligase III die Aktivität von PARP . hemmt in vitro, wenn seine Menge die Anzahl von PARP überschreitet.
Reparationsmodell mit Anti-Rekombinationseffekt des Poly-ADP-Ribose-Polymerase-Enzyms
In den letzten Jahren wurde ein Modell der DNA-Reparatur mit dem Antirekombinationseffekt von PARP vorgeschlagen (Satoh und Lindahl, 1992). Nach diesem Modell interagiert PARP mit DNA-Brüchen und schützt zusammen mit Poly-ADP-Ribosylierungsreaktionen benachbarter Proteine spezifisch DNA-Enden vor Nukleasen und/oder blockiert den Rekombinationsprozess. Dies wird am Beispiel von Versuchstieren, denen das PARP-Gen fehlt, bestätigt. Es hat sich gezeigt, dass das Fehlen von PARP den Rekombinationsprozess stimuliert und zu einer Erhöhung der Häufigkeit der Lymphombildung bei ihnen führt. Darüber hinaus kann PARP DNA-Reparaturfaktoren rekrutieren, indem es Chromatinproteine modifiziert.
DNA-Reparatur mit Methyltransferasen
Unter Verwendung der unterstützenden Enzyme Cytosin-DNA-Methyltransferasen (M-Pelasen) ist es möglich, Cytosinreste in DNA de novo zu 5-Methylcytosin (5-mC) zu methylieren sowie Oligonukleotide mit fehlgepaarten Basen zu methylieren.
DNA-Reparatur mit Helikasen
Unter den Enzymen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, wird der Gruppe der DNA-Helikasen (Chilasen) große Aufmerksamkeit geschenkt. Dies sind phylogenetisch stabile Enzyme, die in der Lage sind, die Ketten eines DNA-Moleküls zu trennen und es von einem nativen in einen einzelsträngigen Zustand umzuwandeln. Helicasen sind an allen grundlegenden genetischen Prozessen mit der Trennung der Elternketten des DNA-Moleküls oder auf einer solchen Trennung basierenden Prozessen beteiligt: Replikation, Transkription, Rekombination, Reparatur, Chromosomensegregation, Prozessierung und Spleißen von prä-mRNA, Transport von mRNA in die Zytoplasma und seine Translation auf Ribosomen (siehe Kapitel 2 und 3). Während dieser Prozesse ermöglichen Chylasen den Zugang zu den einzelsträngigen Regionen des DNA-Moleküls, die sie für die Wirkung anderer Enzyme öffnen. Chylasen unterscheiden sich in den Aktivitätsrichtungen (3"- 5" und 5"-3") der DNA-Kette, bevorzugte Affinität für die 3"- und 5"-Enden der DNA-Kette, Affinität für Cofaktoren - Nukleotide Triphosphate. Diese flüchtigen Fer-
Die Mittel verbrauchen die bei der Hydrolyse von Nukleotid-5'-triphosphaten (meist ATP) gebildete Energie und wirken in Gegenwart von Mg 2+ -Ionen Bei jedem genetischen Prozess werden Chilisen in der Regel zu Komplexen kombiniert.
Durch ihre Affinität zum Substrat werden Chilasen in Gruppen eingeteilt: DNA-Helikasen, RNA-Helikasen und Helikasen, die auf hybriden RNA/RNA-Molekülen arbeiten. Erstere sind an der Initiation der Transkription, Rekombination, Reparatur und Segregation von Chromosomen beteiligt. Letztere sind an der Ribosomenbiogenese, der mRNA-Transkription, dem Prä-mRNA-Spleißen, der Reifung und dem Transport von mRNA in das Zytoplasma und ihrer Translation auf Ribosomen beteiligt.
Chilasen werden nach Aktivität (der Fähigkeit, sich entlang des DNA-Moleküls zu bewegen und es in separate Ketten zu teilen) klassifiziert, nach dem Vorhandensein von 7 spezifischen Motiven von Aminosäuresequenzen, die der gesamten Familie der Chilasen innewohnen, aber für einige von ihnen nicht erforderlich sind. Diese Motive werden mit Nummern bezeichnet: I, Ia, II, III, IV, V und VI (sie stellen die Bindungen der Chylasen an die DNA und die Koordination der Bewegung während der Katalyse bereit). Und obwohl diese Motive spezifisch für Chilasen sind, werden sie auch in Proteinen gefunden, die Nukleotidtriphosphate als Cofaktor verwenden (wie Chylasen). Mutationen in diesen Motiven verursachen einen Mangel in der ATP-abhängigen Aktivität von Chylasen. Zusammen mit Chylasen wurden Proteine mit Motiven isoliert, die keine Chylase-Aktivität besitzen. Es waren auch 7 von ihnen, und sie haben den Namen bekommen Proteinkandidaten für Chilis. Es wird angenommen, dass solche Proteine auch an der Regulierung intrazellulärer genetischer Prozesse beteiligt sein sollten.
Darüber hinaus wurden zwei Mechanismen für die Bewegung von Chylasen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit entlang der Nukleotidkette des DNA-Moleküls identifiziert: ein aktiv rollendes Modell und ein allmählich gleitendes Modell.
Der erste Mechanismus wird von einem Dimer der DNA-Helikase ausgeführt, das in einem Zyklus (Rotation des Moleküls) eine bestimmte Anzahl von bp trennt.
Zweiter Mechanismus wird von einem DNA-Helikase-Monomer durchgeführt, das sich mit einer bestimmten Geschwindigkeit bewegt.
Die Anzahl und Eigenschaften von Genen, die im menschlichen Genom für Helikasen kodieren, wurde nicht endgültig bestimmt, aber einige Gene sind gut untersucht. Dies sind Helikasegene, die zu den TFIIH- und RecQ-Familien gehören. Darüber hinaus ist die erste Familie der Haupttranskriptionsfaktor, bestehend aus neun Untereinheiten, darunter zwei Chylasen (XPB und XPD), 4 Proteine (p62, p52, p44 und p34), ein CAK-Komplex,
aktivierende Kinase (CDK-aktivierende Kinase) und 2 Cycline (H und Cdk7).
TFIIH besitzt eine ATP-abhängige Helikase- und Kinaseaktivität, für die die XPB- bzw. XPD-Untereinheiten verantwortlich sind. Kinaseaktivität wird auch durch den SAK-Komplex bereitgestellt.
Es wurde auch gezeigt, dass TFIIH an der DNA-Reparatur beteiligt ist (es „erkennt“ ein 20-30 bp großes DNA-Fragment, das eine Läsion enthält, und schneidet es aus) und dient als Transkriptionsfaktor (interagiert mit der Promotorregion, entwindet eine 11-13 bp DNA-Segment um die Transkriptionsinitiationsstelle).
Reparatur von Nonsense-mRNA-Transkripten
Etwa ein Drittel der Erbkrankheiten und vieler Krebsarten sind auf unsinnige Transkripte zurückzuführen oder Frame-Shift-Mutationen(siehe Kapitel 5). Als Folge dieser Mutationen entstehen PSCs und defekte Proteine.
Gleichzeitig gibt es in Zellen Systeme, die die meisten Nonsense-Transkripte erkennen und zerstören. Zwei solcher (für Eukaryoten universellen) Systeme heißen NMD und SMD (siehe Kapitel 7).
Zum Abschluss der Betrachtung zellulärer DNA-Reparatursysteme ist festzuhalten, dass die Wiederherstellung von Defekten, die in einem DNA-Molekül durch Exposition gegenüber mutagenen Faktoren entstanden sind, die wichtigste Eigenschaft aller lebenden Organismen ist.
Unter der zunehmenden Zahl von DNA-Reparaturmechanismen gibt es Mechanismen einfach, unmittelbar nach Schädigung des DNA-Moleküls ausgelöst, und Komplex,über die Zeit gestreckt und erfordert die Synthese einer Reihe von Enzymen. Letztere umfassen Mechanismen, die mit verschiedenen Stadien des Lebenszyklus der Zelle verbunden sind, sowie die Zellrettung in der SOS-Reihenfolge oder die Reihenfolge der Einführung neuer Mutationen in das DNA-Molekül. Alle Reparaturmechanismen haben gemeinsame pathogenetische Merkmale und sind eng mit den Prozessen der Karzinogenese, Mutagenese, Teratogenese und Alterung der Zelle und des Organismus verwoben.
KRANKHEITEN DES GENOMS
Erkrankungen des Genoms (genetische Instabilität) sind in allen Bereichen der molekularen Medizin vertreten. Seit der Zeit der klassischen Genetik sind die bekanntesten Reparationskrankheiten.
In Russland in den 80-90er Jahren des XX Jahrhunderts. DNA-Reparaturkrankheiten wurden unter dem Namen von Krankheiten der genetischen (chromosomalen) Instabilität untersucht, die ihrem Hauptmerkmal - der erhöhten Brüchigkeit der Chromosomen - entsprachen.
Aktuell wurde das Spektrum dieser Erkrankungen deutlich erweitert. Neben den klassischen Erkrankungen der DNA-Reparatur, wie Ataxie-Teleangiektasien (AT), Fanconi-Anämie (AF), Xeroderma pigmentosa (PC), Hutchinson-Guildford-Progerie (PRHG), Bloom-Syndrom (SB), gehören folgende Krankheitsgruppen zu dieser Klasse:
Autoimmunerkrankungen: systemischer Lupus erythematodes, Sklerodermie, rheumatoide Arthritis usw.;
Hereditäre Fermentopathien: Knapp-Comrover, Lesha-Nyana, Pendreda usw .;
Chromosomale Syndrome: Down, Klinefelter, Patau, Shereshevsky-Turner und Edwards; Retinoblastom aufgrund einer Deletion von Chromosom 13 (13q14);
Monogene Erkrankungen: Friedreich-Ataxie, Darier-White-Krankheit, Gardner-Syndrom, Basalzellnävus, Marfan, Rothmund-Thomson, Cornelia de Lange, Hodenfeminisierung, Photodermatose usw .;
Polygene Erkrankungen: Psoriasis, systemische Sklerose usw. Genetische Instabilität manifestiert sich auch praktisch
gesunde Träger ausgewogener Chromosomenumlagerungen, zum Beispiel mit Translokationen vom Robertson-Typ zwischen den Chromosomen
Die allgemeinen klinischen Manifestationen von Genomerkrankungen sind: ausgeprägte neurologische Manifestationen, reduzierte Lebenserwartung, Symptome vorzeitiger Alterung und eine erhöhte Inzidenz bösartiger Tumoren.
Betrachten wir zunächst Beispiele für klassische Genomkrankheiten oder DNA-Reparaturkrankheiten.
Monogene Erkrankungen, die mit erhöhter Lichtempfindlichkeit und beeinträchtigter DNA-Reparatur bei Exzision einhergehen
Die bekannteste Krankheit in dieser Klasse ist PC. Seine Häufigkeit in der Bevölkerung beträgt 1: 40-250 Tausend Menschen. PC ist erste Krankheit DNA-Reparatur beim Menschen beschrieben. Es ist heterogen: Es hat 7 Komplementationsgruppen - A, B, C, D, E, F und G. Insbesondere
Gruppe A ist in Japan weit verbreitet, macht dort etwa 20 % aller Patienten mit PC aus und ist mit einem Defekt des postreplikativen Reparatursystems (HR ma1) verbunden. Die Komplementärgruppen B und C sind in Europa üblich und die Gruppen D, E, F und G - in anderen Ländern der Welt.
Das PC-Gen der Gruppe A ist am Locus 9q34.1 lokalisiert. Sein Produkt ist ein DNA-bindendes Protein mit zwei Zinkfingermotiven (siehe Kapitel 8).
Das PK-Gen der Gruppe B ist dem 2q21-Locus zugeordnet, sein Proteinprodukt ist die Helikase, die Teil des TFIIH-Transkriptionsfaktors ist (siehe oben).
Das PK-Gen der Gruppe C ist auf Chromosom 3 kartiert und kodiert für das p125-Protein. Die Funktion dieses Proteins ist nicht endgültig geklärt, obwohl bekannt ist, dass es zusammen mit dem p58-Protein an der Wiederherstellung der Reparaturaktivität beteiligt ist.
Das PK-Gen der Gruppe D ist dem Locus 19q13.2-q13.3 zugeordnet, sein Proteinprodukt (wie das Produkt des PK-Gens der Gruppe B) ist durch Helikaseaktivität gekennzeichnet. Es wird angenommen, dass beide Genprodukte zwei Untereinheiten desselben TFIIH-Faktors sind.
Das PK-Gen der Gruppe F ist dem 16p13.13-Locus zugeordnet und produziert eine Endonuklease, die DNA von der 5'-Seite schneidet.
Das PK-Gen der Gruppe G wird auf den 13q33-Locus kartiert und produziert ebenfalls Endonuklease, aber Kerben-DNA von der gegenüberliegenden 3'-Seite.
Die Hauptsymptome dieser Krankheit sind: hohe Empfindlichkeit gegenüber der Einwirkung von ultravioletter Strahlung, Pigmentierung, Trockenheit, Geschwürbildung und Narbenbildung der Haut. Die Patienten entwickeln Haut- und Schleimhautkrebs (Melanom, Karzinom).
In jedem zweiten oder dritten Fall werden neurologische Symptome exprimiert (verbunden mit einem frühen apoptotischen Tod von Neuronen).
In den letzten Jahren wurde festgestellt, dass 3 von 7 Gruppen der PC-Komplementation (Gruppen B, D und G) sich als Genokopie einer anderen DNA-Reparaturkrankheit manifestieren können - Cockayne-Syndrom (SC), verursacht durch Defekte in Endonukleasen der Exzision Reparatursystem an.
In solchen Fällen ist es bei Patienten mit PC möglich, bei SC häufige klinische Symptome zu unterscheiden, einschließlich Überempfindlichkeit gegenüber ultravioletter Strahlung. Daher werden Diagnosen bei solchen Patienten als PKV / CK, PKD / CK, PKG / CK bezeichnet.
Gleichzeitig ist Großbritannien zweite Krankheit(nach PC), beschrieben als Exzisionsreparaturkrankheit. Dieses Syndrom äußert sich in Kleinwuchs (mit einem normalen Wachstumshormonspiegel), Verkalkung der Schädelknochen, Atrophie der Sehnerven, Taubheit und beschleunigtem Altern. Bei diesem Syndrom wurden zwei Komplementationsgruppen identifiziert: A und B. Das CK-Gen der Gruppe A ist am 5p12-p14-Locus lokalisiert und kodiert für ein Protein, das Teil des TFIIH-Transkriptionskomplexes ist (siehe oben). Das CK-Gen der Gruppe B ist am 10q11.2-Locus lokalisiert, es kodiert für ein Protein, das Nukleotidsequenzen mit einem Faktor teilt, der die Transkription und Reparatur in E. coli kontrolliert, beim Menschen zieht es anscheinend Exzisions-Reparaturproteine in die Region von gestoppt Transkription.
Dritte Krankheit Die DNA-Reparatur ist Trichotodystrophie (TCD). Bei dieser Krankheit manifestiert sich bei etwa der Hälfte der Patienten eine Überempfindlichkeit gegenüber ultravioletter Strahlung.
Die Krankheit geht mit einer erhöhten Haarbrüchigkeit einher, die mit einer Abnahme der Konzentration von schwefelhaltigen Proteinen in ihnen verbunden ist, die an Cysteinmangel leiden.
Zum Hauptsymptomkomplex umfassen: Anomalien in der Zahn- und Hautentwicklung, Ichthyose, verzögerte sexuelle Entwicklung, körperliche und geistige Behinderung, Prädisposition für Hautkrebs.
In einer Reihe von Fällen wurde die Übereinstimmung eines DNA-Reparaturdefekts in TCD mit den Reparaturdefekten festgestellt, die in allen Gruppen der PK-Komplementation, mit Ausnahme von Gruppe B, festgestellt wurden.
Diese Korrespondenz ist besonders oft charakteristisch für das PK-Gen der Gruppe D. In dieser Hinsicht wurde vorgeschlagen, dass das PK-D-Gen polyfunktionell ist und sein Proteinprodukt an der Exzisionsreparatur und der Transkription abhängig von der RNA-Polymerase P beteiligt ist Patienten mit TCD werden nicht zwei, sondern vier Untereinheiten des Transkriptionsfaktors TFIIH produziert.
Vierte Krankheit verbunden mit erhöhter Lichtempfindlichkeit und gestörter DNA-Reparatur ist das Bloom-Syndrom (SB).
Das SB-Gen oder BLM-Gen (Bloom-Mutation) wird am Locus 15q26 neben dem fes-Protonkogen kartiert. Es wird angenommen, dass dieses Gen eine DNA-abhängige ATPase- und DNA-abhängige Helikase-Aktivität besitzt, wobei erstere mit der Aufrechterhaltung der Chromosomenstabilität in somatischen Zellen verbunden ist und letztere eine Schlüsselrolle bei der DNA-Reparatur spielt.
Symptome von SB: proportionale prä- und postnatale Wachstumsverzögerung, Hyper- oder Hypopigmentierung der Haut, Rötung an
Gesicht in Form eines "Schmetterlings", Veranlagung für Tumore, hohes Niveau spontane Chromosomenaberrationen und SCO.
Monogene Erkrankungen, die mit Doppelstrang-DNA-Brüchen in völliger Abwesenheit von Exzisionsreparatur assoziiert sind
Das einzige Beispiel für eine Krankheit, die mit doppelsträngigen DNA-Brüchen bei völliger Abwesenheit von Exzisionsreparaturmechanismen verbunden ist, ist das AT oder Louis-Bar-Syndrom. Die Krankheit tritt mit einer Häufigkeit von 1: 40-100 Tausend Menschen auf, ist gekennzeichnet durch zerebelläre Ataxie, Teleangiektasien, Immunschwäche, hohe Chromosomenbrüchigkeit und eine Prädisposition für bösartige Tumoren (siehe Kapitel 5).
In den letzten drei Jahrzehnten haben eine Reihe von genetische Merkmale dieser Krankheit. Es stellte sich heraus, dass die Chromosomen von Patienten mit AT die Telomere um fast das Dreifache verkürzt haben, sie (Chromosomen) sind hochempfindlich gegenüber der Einwirkung ionisierender Strahlung und chemischer Radiomimetika, was sich in einer Erhöhung der Ausbeute an Chromosomenanomalien (doppelt- Strangbrüche) und eine Verringerung des Überlebens von somatischen Zellen, die durch eine strahlenresistente DNA-Synthese gekennzeichnet sind, die sich in Abwesenheit der p53-Proteinsynthese manifestiert, die normalerweise für die Verzögerung (Stopp) des mitotischen Zyklus am G 1 . verantwortlich ist -S- und G 2 -M-Stadien, die für die Reparatur von DNA-Schäden notwendig sind. Mit anderen Worten, die Zellen von Patienten mit AT haben „einfach keine Zeit“, die normale DNA-Struktur mithilfe der Mechanismen der Exzisionsreparatur wiederherzustellen. Daher werden post-replikative Reparaturmechanismen verwendet, um Doppelstrang-DNA-Brüche in solchen Zellen zu eliminieren.
Monogene Erkrankungen mit gestörter Exzisionsreparatur unabhängig von Lichtempfindlichkeit und DNA-Doppelstrangbrüchen
Krankheiten mit gestörter Exzisionsreparatur ohne Berücksichtigung von Lichtempfindlichkeit und Doppelstrang-DNA-Brüchen umfassen: Fanconi-Anämie (AF) und Progeroid-Syndrome von Hutchinson-Guildford und Werner.
Fanconi-Anämie
Vorhofflimmern ist eine familiäre hypo- oder aplastische Anämie mit angeborener Insuffizienz der hämatopoetischen Linie des Knochenmarks, Hautpigmentierungsstörungen, Teleangiektasien, BAR und MAP
(siehe Kapitel 23), eine Prädisposition für myeloische Leukämie und andere Symptome.
Ein ständiges Zeichen der Erkrankung ist eine spontane Chromosomeninstabilität in den Zellen des Knochenmarks, der Haut und der Lymphozyten.
Vorhofflimmern ist eine heterogene Krankheit mit 8 Komplementationsgruppen (A, B, C, D, E, F, G und H), auch für die Gruppen A und C werden Gene am 9q22.3-Locus kartiert, ihre Proteinprodukte jedoch nicht gut verstanden... Es sollte die Inkonsistenz der Daten bezüglich des Fehlens einer erhöhten DNA-Photosensitivität bei Patienten mit VHF beachtet werden, obwohl solche Daten zuvor erhalten wurden (Higurashi M., Cohen P. E., 1975).
Progeria Hutchinson-Guildford
PRHG ist eine seltene Erkrankung (Inzidenz 1:1 Mio.). Die Lebenserwartung der Patienten überschreitet in der Regel 15 Jahre nicht. Das Krankheitsgen ist nicht lokalisiert.
Die wichtigsten Symptome: Kleinwuchs, „Vogelprofil“ des Gesichts, Überwiegen des zerebralen Teils des Schädels über dem Gesicht, venöses Netz an Kopfhaut und Stirn, trockene, abgenutzte Haut, Fehlen von Augenbrauen und Wimpern, oft totale Alopezie, Fehlstellen in der Anzahl und Form der Zähne, vollständiges Fehlen von Unterhautfett, Verzögerung der körperlichen, psychomotorischen und geistigen Entwicklung; im Urin - ein hoher Gehalt an Hyaluronsäure. Patienten sind in der Regel unfruchtbar.
Ursachen für einen frühen Tod: Myokardinfarkt mit generalisierter Atherosklerose und Fibrose, Verfettung von Hirngewebe und Parenchymorganen.
In den Zellen von Patienten mit PRCH treten Defekte bei der Reparatur von DNA-Protein-Crosslinks auf, die durch Chemische Komponenten; eine stark reduzierte Hayflick-Zahl und ihr Zusammenhang mit angeborener Verkürzung der Telomere.
In Analogie zu SC (so) wird für die kindliche Progerie (CH) ein autosomal-rezessiv vererbter Erbgang angenommen, obwohl eine neu auftretende autosomal-dominante Mutation möglich ist, die zu einer Telomerverkürzung führt.
Werner-Syndrom
Werner-Syndrom (SV) oder Progerie bei Erwachsenen ist durch vorzeitiges Altern gekennzeichnet, das erst nach der Pubertät auftritt. Die Patienten werden früh grau und kahl (bis 20 Jahre).
Das Krankheitsgen (WRN-Gen) befindet sich am 8p12-p21-Locus, produziert das Enzym Helikase, ist aber nicht Teil des Haupttranskriptionskomplexes TFIIN. Es ist dieses Merkmal, das CB von den PK-Gruppen B und D und CK-Gruppe B unterscheidet, bei denen die Aktivität der Helikase direkt mit der mit der Transkription verbundenen Reparatur zusammenhängt.
Die wichtigsten Symptome:„Alternde Haut“ (Hyperpigmentierung, Hyperkeratose, Faltenbildung, Trockenheit, Teleangiektasien), taube Stimme, Veränderungen der inneren Organe, die für einen alternden Organismus charakteristisch sind (Arteriosklerose des Herzens und der Blutgefäße, Katarakte, Osteoporose, Diabetes mellitus; gutartige oder bösartige Tumoren), im Urin - hoher Hyaluronsäuregehalt. Hayflicks Zahl ist nicht nur durch die Anzahl der Teilungen, sondern auch durch die Dauer des Zellzyklus (3-5 mal niedriger als normal) stark begrenzt. Im Gegensatz zu PRCH weisen die Chromosomen der Patienten bei SV keine verkürzten Telomere auf.
Onkologische Erkrankungen im Zusammenhang mit einer gestörten Reparatur
Nach der Beschreibung des Retinoblastoms durch die Deletion von Chromosom 13 (13q14; siehe Kapitel 17 und 25) begann eine intensive Forschung zur Rolle von Genmutationen bei erblichen Krebserkrankungen. Es wurde gezeigt, dass Genmutationen bei vielen Krebsarten zu einer gestörten Reparatur von Basenfehlpaarungen führen, die als Replikationsfehler (aufgrund kleiner Deletionen oder Insertionen) auftreten. Solche Mutationen sind analog zu Mutationen im mutS-Gen in E. coli, was zu einer beeinträchtigten Basen-Mismatch-Reparatur führt.
Beim Menschen verursacht eine Mutation in einer der Kopien des MSN2-Gens (mit hoher Wahrscheinlichkeit) die Entwicklung von familiärem Dickdarmkrebs (HNPCC) und Endometriumkarzinom. Es wurde auch festgestellt, dass bei diesen Erkrankungen die zweite Kopie des Gens in Tumorzellen fehlt und eine extrem hohe Häufigkeit von Mikrosatelliten-Wiederholungen festgestellt wird (100-mal höher als die Norm). Darüber hinaus sind mit den Genen BRC1 und BRC2 assoziierte Formen von Brustkrebs beim Menschen, Formen der Alzheimer-Krankheit, die mit vier Genen (PS1-PS4) und dem Prionprotein-Gen assoziiert sind, sowie andere Beispiele für die Genkopie einer Reihe von monogenen und polygenen Beim Menschen wurden tumorassoziierte Erkrankungen festgestellt (siehe Kapitel 17 und 25).
Thema Inhaltsverzeichnis "Genetische Elemente von Bakterien. Mutationen in Bakterien. Transduktion.":1. Migration von genetischen Elementen von Bakterien. Transposons. Bakteriophagen als wandernde genetische Elemente.
2. Mutation. Mutationen in Bakterien. Mutagene. Spontane Mutationen. Rückmutationen (Reversionen).
3. Induzierte Mutationen von Bakterien. Chemische Mutagenese. Strahlenmutagenese. Arten von Mutationen.
4. DNA-Reparatur von Bakterien. DNA-Reparatursysteme. Kompensation von durch Mutationen beeinträchtigten Funktionen. Intragene Unterdrückung. Extragene Unterdrückung.
5. Übertragung bakterieller DNA. Konjugation von Bakterien. F-Faktor-Bakterien.
6. Transformation von Bakterien. Stadien der Bakterientransformation. Kartierung der Chromosomen der Bucketteria.
7. Transduktion. Unspezifische Transduktion. Spezifische Transduktion. Abortive Transduktion. Das Phänomen der Lysogenese.
8. Eigenschaften von Bakterien. Nicht vererbte Veränderungen der Eigenschaften von Bakterien. S - Kolonien. R - Kolonien. M - Kolonien. D - Bakterienkolonien.
DNA-Reparatur von Bakterien. DNA-Reparatursysteme. Kompensation von durch Mutationen beeinträchtigten Funktionen. Intragene Unterdrückung. Extragene Unterdrückung.
Es gibt Mechanismen in der Zelle, die die ursprüngliche Struktur der veränderten DNA ganz oder teilweise wiederherstellen können. Mutationen, die durch Strahlung, Chemikalien und andere Faktoren verursacht werden, könnten theoretisch zum Aussterben der Bakterienpopulation führen, wenn dieser die Fähigkeit genommen würde, DNA-Reparatur... Die Reihe von Enzymen, die die Korrektur von DNA-Schäden katalysieren, werden zu den sogenannten Reparatursystemen zusammengefasst, die sich in den biochemischen Mechanismen der "Heilung" von Schäden grundlegend unterscheiden. Es gibt drei Hauptrichtungen zur Korrektur von DNA-Defekten.
1. Direkte Rückkehr von beschädigte DNA zur ursprünglichen Struktur, wenn Veränderungen in der DNA werden durch eine einzige enzymatische Reaktion korrigiert. Zum Beispiel Entfernung der falsch gebundenen Methylgruppe am sechsten Sauerstoffatom von Guanin mit Methyltransferase; oder Spaltung des bestrahlten Thymindimers durch Photolyase ( Rekombinationsreparatur).
2. "Schnittschaden" mit anschließender Wiederherstellung der ursprünglichen Struktur (Exzisionsreparatur).
3. Aktivierung spezieller MechanismenÜberleben im Verletzungsfall sichern DNA(Wiederherstellung der ursprünglichen Struktur DNA als Ergebnis der Rekombination; Korrektur von nicht übereinstimmender Basenpaarung; Translationale Synthese auf beschädigter Matrix DNA). Diese Mechanismen führen nicht immer zu einer vollständigen Wiederherstellung der ursprünglichen DNA-Struktur.
Kompensation von durch Mutationen beeinträchtigten Funktionen
Primärmutation kann durch eine sekundäre Mutation kompensiert werden, die innerhalb des mutierten Gens (intragen) oder in einem anderen Gen (extragen) aufgetreten ist. Veränderungen, die die Manifestationen der Mutation beseitigen, ohne die ursprüngliche Störung zu korrigieren DNA werden genannt Unterdrückung.
Intragene Suppression verursacht durch eine sekundäre Mutation, die die Auswirkungen der primären Mutation korrigiert. Beispielsweise kann eine Punktmutation, die zur Synthese eines defekten Proteins mit verlorener biologischer Aktivität führt, korrigiert werden, wenn eine sekundäre Punktmutation zu einer Aminosäurekodierung führt, die die Konfiguration und Aktivität des Proteins beibehält. Die genaue Wiederherstellung der ursprünglichen Genstruktur wird als echte Umkehrmutation bezeichnet ( wahre Umkehr). Wird die Wirkung der ersten Mutation durch eine Mutation in einem anderen Teil des Gens kompensiert, werden solche Mutationen als sekundäre Reversionen bezeichnet.
Extragene Suppression- Unterdrückung der Manifestation einer Mutation, die in einem Gen aufgetreten ist, aufgrund einer Mutation im zweiten Gen.
